常见技术问题

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Q1:抗体的保存温度是不是越低越好?


关于抗体的保存,原则上建议:

1、离心

收到抗体后,4℃,12000rpm,离心 3 分钟,再打开管盖进行分装、溶解和保存(如果抗体体积大于 50µl,请延长离心时间至 5 分钟,以保证全部抗体和重组蛋白均离心下来。

2、长期保存

对绝大多数抗体来说,保存在-20℃是完全足够;

分装抗体可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害,同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性;

分装的量以一次实验用完为好,最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小,抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响;

复融后的分装抗体如果一次用不完,将剩余母液保存在4℃,避免再冻起来;

抗体工作液应该当天配制当天用完,在4℃ 尽量不要超过1天。

绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中,尽量将抗体保存在冰箱里层,而不是门上,避免温度变化造成反复冻融。

3、短期保存

大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。

如果抗体很快(1-2周)会使用,推荐在4℃保存,这是为了避免反复冻融对抗体活性的损害;

如果要长期保存则最好是在-20℃,最关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体;

腹水形式的产品请在收到后立即冻起来,因为该类产品含有大量的蛋白酶,长期在4℃保存会导致抗体的降解。

4、运输

一般的运输过程需要 1~2 周的时间,所以是在低温 4℃ 的条件下来完成的。

4℃运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害。(如使用干冰运输,那么收到时抗体是冻起来的,为了分装就需要解冻。这就多了一次冻融的过程,所以运输过程中绝对避免干冰运输。)

5、特殊抗体的保存条件:

a、酶联抗体:
永远保存在4℃,避免冻起来。否则会导致酶活性的下降或者丧失

b、偶联抗体:
所有偶联抗体都是在棕色管中或使用锡箔纸避光保存。尤其是荧光抗体,对光极为敏感,因此在所有的实验阶段也是要避光操作的!

c、igg3的同型对照:
永远保存在4℃,避免冻起来。因为如果出现冻融过程,该抗体非常容易形成多聚体。

注意事项:
无论是保存还是运输,绝对避免反复冻融!
反复冻融会导致抗体变性,导致多聚体形成,从而降低抗体的结合能力!

Q2:当抗体杂带比目的带还要粗很多,如何确定目的条带?


目的带确定:
参照理论分子量:大部分抗体的检测结果与理论分子量比较相近,检测结果误差在10-15%以内都可以认为是正确条带。目的蛋白的理论分子量可以参照uniprot上的数据: http://www.uniprot.org/ 一些抗体的检测结果跟理论分子量相差较大,可能的原因:
1、目的蛋白有多个修饰位点如糖基化修饰。
2、目的蛋白与其他蛋白在体内形成稳定复合物。
3、目的蛋白被剪切。
4、个别特殊蛋白,如ubiquitin蛋白
5、二聚体或多聚体

1、糖基化修饰对分子量的影响

以LAMP1为例,下图是自产抗体检测结果,120KD的条带和47KD的条带都认为是目的带。

通过uniprot查找发现LAMP1的理论分子量为45:

同时在uniprot中发现该蛋白存在多个糖基化修饰位点,如下图:

因为目的蛋白存在多个糖基化位点,所以检测条带可能会远远大于理论分子量,为了证明我们的推测查找其他公司的检测结果:

另外abcam和PTG也有类似的检测结果,所以我们抗体检测到的2条带都是目的带,没有任何疑问。

2、复合物对分子量的影响

以ATG5为例,ATG5的检测结果,如下图:

ATG5的理论分子量为32 kD,无相应的糖基化修饰,但能够跟ATG12蛋白形成复合物:

根据这些信息可以初步推测我们检测出的条带是ATG5+ATG12的大小,同时参照其他公司检测结果(如下图),综合以上数据可以知道ATG5检测到的55KD的条带是目的带。

3、剪切体对分子量大小的影响

以LTF为例,检测结果如下,理论分子量为78,我们的检测结果在50附近:

在uniprot中找不到相关的依据,对检测结果有疑问,通过查找发现有文献报道该蛋白可以被水解成50和30的两条带,所以我们检测到的条带是目的带(This protein has 2 isoforms produced by alternative promoter usage. The human LTF can be isolated two fragments, an N-terminal tryptic fragment having an Mr of 30 kDa and a C-terminal tryptic fragment having an Mr of 50 kDa by a mild tryptic digest(PMID:3790094))。

Q3:ABclonal抗体中会不会添加防腐剂,对抗体的使用效果产生影响?


抗体中常用的防腐剂:叠氮钠(NaN3)。ABclonal品牌产品,以及其他如PTG、ABcam等都是以这种防腐剂为主,其他的还有硫柳汞。

作用:叠氮钠,主要为了保持抗体的无菌性,叠氮钠对于抗体有防腐稳定的作用.叠氮钠主要是抑制细菌等微生物的生长,保证抗体的稳定。

有叠氮钠的抗体主要应用于WB、IHC、IF、IP、FC。不含叠氮钠等防腐剂,常用于 “生物功能检测” 和 “活细胞研究”,例如某些细胞培养中加入抗体可以抑制细胞凋亡;刺激T淋巴细胞激活的CD3 CD28抗体等。

注意事项:

HRP标记的二抗不能加叠氮钠,否则会抑制显色,因为前者是后者的不可逆抑制剂,所以二抗都不会添加叠氮钠。但一抗一般除非用于细胞培养或者涉及一些功能性实验,一般都会有微量的叠氮钠。

叠氮钠会影响HRP二抗的活性。但在一般的Western blot实验中,一抗一般含有少量的叠氮钠,不过在上二抗之前就会被洗掉,所以不会影响后面的结果。主要需要考虑二抗以及以后的步骤,一般商品化的PBS或TBS缓冲液中可能含有叠氮钠,在购买这些产品时要仔细阅读商家提供的说明书,确认是否含有叠氮钠。

总结,防腐剂能够抑制细菌等微生物的生长,保证抗体的稳定。含有防腐剂的抗体不能用于“生物功能检测” 和 “活细胞研究”,不能与HRP标记的二抗直接作用,其他情况下对实验基本无影响。

Q4:ABclonal的抗体制备周期多久?制备成功率怎么样?


我们的抗体制备周期大概4个月的时间,抗体制备的流程为克隆—表达—免疫—纯化—检测。

克隆为客户提供构建到载体上的模板,我们安排测序正确后,根据设计报告选择区段构建到表达载体,周期为两周以内,客户如果想缩短该周期,建议客户提供模板的量要多一些,至少15ul,同时提供给我们测序结果,因为如果量不足,我们需要安排转化后再测序,耽误2-3天时间,客户也可提供表达载体我们直接安排表达;表达为将表达载体原核诱导表达,周期为2周以内,客户如提供表达载体,请客户提供表达条件和表达图,以供参考,以节省我们摸索表达条件;免疫周期为兔子68天,免疫次数为4次,根据我们免疫经验,4免效果较好,缩短免疫周期,抗体浓度,效价肯定差一些,我们生产的抗体浓度一般在1.0mg/ml以上,抗原检测1:1000至少检测到10ng抗原蛋白,其他公司有这种保证吗?如果客户实验比较急,我们可以为客户取少量三免血清进行内源检测,节省2周左右时间;动物牺牲后,抗体纯化检测时间为3周左右,如果客户比较急抗体纯化完成后就可为客户安排发放小样进行内源检测,我们同时进行抗原检测,纯化时间10天左右。

我们制备的抗体是抗原验证保证的,表达路线抗体1:1000稀释保证检测到10ng抗原,多肽路线Dot blot实验中保证抗体1:1000稀释能检测到100ng抗原,如抗原验证不成功,我们不收取任何费用,只有个别蛋白或多肽本身性质较差,无法检测到抗原。内源由于蛋白本身表达量,客户操作水平等差异,我们是无法进行保证的,这个风险需要客户和我们共同去承担,内源验证不成功,我们只收取50%首款作为我们的成本费用。我们对多年抗体制备的数据进行分析,内源成功率表达路线在70%-80%,多图路线风险稍大一些,为60%-70%。