Lysozyme (LYZ) Rabbit mAb (A10972)

All
WB
IHC-P
IF/ICC
ELISA

Western blot analysis of various lysates, using Lysozyme (LYZ) Rabbit mAb (A10972) at 1:20000 dilution.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25μg per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 90s.

Immunohistochemistry analysis of Lysozyme (LYZ) in paraffin-embedded mouse spleen tissue using Lysozyme (LYZ) Rabbit mAb (A10972) at a dilution of 1:4000 (40x lens). High pressure antigen retrieval was performed with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) prior to IHC staining.

Immunohistochemistry analysis of Lysozyme (LYZ) in paraffin-embedded human spleen tissue using Lysozyme (LYZ) Rabbit mAb (A10972) at a dilution of 1:4000 (40x lens). High pressure antigen retrieval was performed with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) prior to IHC staining.

Immunohistochemistry analysis of Lysozyme (LYZ) in paraffin-embedded human colon tissue using Lysozyme (LYZ) Rabbit mAb (A10972) at a dilution of 1:4000 (40x lens). High pressure antigen retrieval was performed with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) prior to IHC staining.

Immunohistochemistry analysis of Lysozyme (LYZ) in paraffin-embedded human tonsil tissue using Lysozyme (LYZ) Rabbit mAb (A10972) at a dilution of 1:4000 (40x lens). High pressure antigen retrieval was performed with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) prior to IHC staining.

Immunofluorescence analysis of paraffin-embedded Human stomach using Lysozyme (LYZ) Rabbit mAb (A10972) at a dilution of 1:400 (40x lens). Secondary antibody: Cy3 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS007) at 1:500 dilution. Blue: DAPI for nuclear staining.

All(6)|

货号: A10972

文献引用 (0)

客户数据及评论 (2)

折叠内容

CustomerSep 082023

评分
Experiment Type: IHC
Sample: Kidney
Description: Immunohistochemistry analysis of Kidney , using Lysozyme (LYZ) monoclonal Antibody at a dilution of 1:1000.

CustomerSep 082023

评分
Experiment Type: IHC
Sample: spleen
Description: Immunohistochemistry analysis of spleen , using Lysozyme (LYZ) monoclonal Antibody at a dilution of 1:1000.

详细信息

推荐稀释比

WB1:2000 - 1:20000
IHC-P1:1000 - 1:5000
IF/ICC1:100 - 1:500

浓度查询

请输入产品标签上的lot号，例如4000000001

反应物种

Human, Mouse, Rat

同种型

IgG

理论分子量

17kDa

实际分子量

15kDa

克隆号

ARC57153

产品形式

Liquid

偶联物

Unconjugated

存储缓冲液

Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.
Buffer: PBS with 0.05% proclin300,0.05% BSA,50% glycerol,pH7.3.

阳性样本

U-937,RAW 264.7,Mouse lung,Rat lung

细胞定位

Secreted

纯化方式

Affinity purification

抗原信息

免疫原

A synthetic peptide corresponding to a sequence within amino acids 1-100 of human Lysozyme (LYZ) (NP_000230.1).

序列

MKALIVLGLVLLSVTVQGKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCS

进行序列比对

用户验证的应用

应用及物种

背景信息

This gene encodes human lysozyme, whose natural substrate is the bacterial cell wall peptidoglycan (cleaving the beta[1-4]glycosidic linkages between N-acetylmuramic acid and N-acetylglucosamine). Lysozyme is one of the antimicrobial agents found in human milk,and is also present in spleen,lung,kidney,white blood cells,plasma,saliva,and tears. The protein has antibacterial activity against a number of bacterial species. Missense mutations in this gene have been identified in heritable renal amyloidosis.

RRID

AB_2758350

基因ID

4069

Swiss Prot

P61626

别名

LZM; LYZF1; Lysozyme (LYZ)

关联靶点

以LYZ为关键词搜索文献记录，得到上述基因与LYZ的研究紧密相关，排序顺序根据研究相关程度由高到低决定。（所显示数字代表两者共同出现的已发表文献数量）

◀1/▶

关联领域

以LYZ为关键词搜索文献记录，得到上述相关热词信息，可反映出LYZ的研究趋势与热点。（关联领域与基因名称的距离代表其研究热度）

* 该数据来源于赛特新思(citexs.com)
来自于发表文献，仅供参考所用，ABclonal不承担任何责任。

暂无以LYZ为关键词搜索的文献记录。

该服务由赛特新思提供，上述关联分析来自已发表文献，仅供参考所用，ABclonal不承担任何责任。

FAQ

折叠内容

ABclonal公司的抗体，可以回收利用几次？

首先，一般抗体不推荐客户回收利用，抗体使用之后缓冲体系已经发生改变，不同客户在回收抗体的保存条件上也会有差异，所以抗体回收使用效果无法保证。另外，ABclonal公司也做过一批抗体回收验证测试，测试结果显示不同抗体可回收次数不同，一般效价越高的抗体，可重复使用的次数越多，客户可根据实验情况来确定。
注：我们将孵育完毕后剩余的抗体回收到离心管中置于4℃保存，效价高的抗体可至少保存1周，至少重复利用3次。

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ABclonal作为国产抗体品牌的优势？

武汉爱博泰克生物（ABclonal）科技有限公司是国产品牌，她成立于2011年，公司依托ABclonal美国波士顿抗体与蛋白研发中心、中国光谷生物城(武汉)抗体生产基地以及上海张江分子酶研发中心，凝聚了十余位来自哈佛大学、麻省理工、复旦大学、上海交大、中科院生化细胞所和武汉大学的全球知名分子和免疫学方面博士，组成我们的科学家团队，通过聚焦抗体与酶核心技术，致力于打破国际技术的垄断，将公司打造成为科研工具和诊断原料的国内领导品牌，乃至弯道超越国际巨头。我们拥有包括兔多克隆抗体、小鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体的生产研发平台，同时也有包括WB,IHC,IF,IP,CHIP在内的检测平台，我们对每一支自产的抗体进行了严格的检测。当然，我们部分直销地区也可以帮客户代购进口品牌的产品。同时也有抗体定制服务。ABclonal抗体优势：1，严自检，保质量；2产品多，指标全；3，价格低，货期短。注：ABclonal抗体价格体系详情见附件

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ABclonal抗体成分？

ABclonal抗体成分在平时工作当中，常会有客户咨询我们的抗体用的什么buffer进行保存，一般来说，我们的buffer的成分是：PBS含0.03%的proclin300、0.05%牛血清白蛋白、50%甘油；也有一些是PBS含0.03%的proclin300，50%甘油。防腐剂 Proclin 300活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MCI）和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMCI）。ProClin生物灭活剂能够迅速穿透细胞膜，抑制对细胞呼吸至关重要的特定酶，因此一接触微生物有机体就会立即抑制细胞活性。ProClin的多个特定毒性位点可以防止微生物产生高水平的耐药性。

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实验方案

折叠内容

蛋白免疫印迹实验步骤

一、实验仪器及试剂

1、样品制备试剂

a. RIPA 裂解液
b. 蛋白酶抑制剂
c. BCA工作液
d. BSA Standard Solution(5mg/ml)（RM00005）
e. 1×PBS缓冲液（RM00012）
f. 5×loading buffer（RM00001）

2、制胶试剂

a．30% Acr-Bis (29:1)（RM00006）
b．1 M Tris-HCl (pH6.8)（RM00003）
C．1.5M Tris-HCl (pH8.8)（RM00002）
d．10% SDS（RM00004）
e．10% Ammonium persulfate (APS)（RM00007）
f．TEMED（RM00009）

3、电泳、转膜试剂及耗材

a. 1X Tris-Glycine SDS Running Buffer（RM00010）
b. 1X Western Transfer Buffer（RM00011）
c. Filter Paper (7.5×10cm)（RM00019）
d. Nitrocellulose membrane（RM00017/ RM02801/ RM00018）

4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂

a. 1XTBST Buffer（RM00013）
b. 1X Western Blocking Buffer（RK05742）
c. Skimmed milk powder（RM00014）
d. Bovine Serum Albumin (BSA)（RM02802）
e. Western Antibody Dilution Buffer（RK05743）
f. HRP 偶联二抗（根据一抗情况选用，AS014/AS003等可供选择）
g. SignalFire™ ECL Reagent（RM00020/RM00021）

二、实验步骤

1、样品制备

（1）细胞收集

a. 贴壁培养细胞收集
用细胞刮刮下细胞或用胰酶消化处理后，400×g，离心5 min，弃上清；用适量冰PBS溶液将离心后细胞沉淀重悬，4℃，400×g 离心5min,弃上清，重复清洗步骤一次收集细胞沉淀。
b. 悬浮培养细胞收集
收集悬浮细胞，400×g离心5min，弃上清，适量冰PBS溶液将离心后细胞沉淀重悬，4℃，400×g 离心5min,弃上清，重复清洗步骤一次，收集细胞沉淀。
c. 组织样本收集
把组织在预冷的表面上剪切成细小碎块，然后用液氮或超低温冰箱中冷冻组织30min以上，迅速加液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。

（2）总蛋白提取

a. 细胞/组织裂解：
根据收集的细胞数量、细胞种类添加适量的裂解液。
例如常规细胞沉淀可按照1mL裂解液/107个细胞的比例加入相应体积的裂解液，加入裂解液后将沉淀吹打混匀。使用细胞破碎仪超声样本，每次超声时间4-5s,间隔时间在5s左右，肉眼观察，样本为均一，不粘稠液体即可。或采用震荡裂解方式进行，每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s，裂解20min。
组织碎片可按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重复5次，使组织尽量碾碎（裂解液中根据需要添加或不添加蛋白酶抑制剂）。所有理解过程，务必在低温条件下进行。
b. 离心：
把裂解好的样品配平后，将裂解好的样本置于预冷的高速冷冻离心机中，13000×g离心10min，收集上清
c. 蛋白变性：
吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入对应体积的5× Loading Buffer（最终工作液为1×)，待干式恒温器温度升至95℃后，将1.5mL离心管插入加热孔中，95℃加热变性10min，待液体完全冷却后置于-20℃保存。

（3）蛋白浓度测定（BCA法）

a. BCA工作液的配置
根据样品数量，按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B（50:1）配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。
b. BSA标准品梯度稀释
取10μl蛋白标准品（5 mg/mL BSA）稀释至50μl，使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1×PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中，加稀释液补足到20μl。
c. 样本浓度测定
加适当体积样品到96孔板的样品孔中，如果样本不足20μl，需加稀释液补足到20μl。每孔加入 200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶标仪测定样本和标准品在562nm下的吸光度，或在540-595nm之间波长下的吸光度。根据BSA蛋白浓度标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

2、凝胶电泳

（1）制胶器安装

根据使用说明书安装。

（2）凝胶配置

根据目标蛋白大小，选择不同合适浓度的分离胶（见附表）。注意该过程注意不能有气泡产生。

（3）上样

待胶凝固好后，用移液器吸取样品垂直梳孔上样，建议总蛋白上样量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm即可。

（4）电泳

上样完成后，连通电泳仪电源，注意正负极需连接正确，设定适宜的电泳参数。建议浓缩胶电泳参数为恒压80V，分离胶采用恒压120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时，停止电泳，关闭电泳仪电源。

3、转膜

（1）准备工作

a. 转膜缓冲液可提前2h （即开始电泳后）放入-20℃冰箱预冷。
b. 根据胶的面积大小，将滤纸以及NC膜剪裁至合适尺寸。
c. 建议目的蛋白大于20KD可选择0.45μm NC膜；目的蛋白小于20KD可选择0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜。选择完毕后将膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用。注意使用PVDF膜需先放入甲醇中浸泡1min左右至均匀浸透，没有白点即可放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

（2）转膜

根据目的蛋白大小，选择合适的转膜条件（见附表）。

4、封闭

转膜完成后，将膜取出，放入合适的抗体孵育槽中，加入Western Blocking Buffer 室温孵育1h，加入TBST Buffer洗涤3次，每次5 min。

5、抗体孵育

根据所使用的一抗种类，选择进行下述其中1项的具体步骤

（1）对于无偶联的一抗

a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗体说明书推荐比例进行稀释,室温孵育1.5h或4℃过夜孵育。
b. TBST Buffer洗涤4次，每次5 min。
c. 按一抗来源选取合适的HRP偶联二抗，按照合适比例进行稀释，室温孵育1h。
d. TBST Buffer洗涤4次，每次5 min。
e. 继续进行后续曝光操作。

（2）对于偶联有HRP的一抗

a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗体说明书推荐比例进行稀释,室温孵育1.5h或4℃过夜孵育。
b. 用TBST Buffer洗涤4次，每次5 min。
c. 继续进行后续曝光操作。

6、曝光

a. 吸取等体积ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ混匀，配制成发光检测工作液。推荐用量为每10cm2的膜使用1-2 mL发光检测工作液即可。
b. 用镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液枪吸取工作液并均匀覆盖转印膜，室温孵育 1-2 minutes，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
c. 获取WB结果：
1) 传统压片曝光显影：将膜固定于片夹内。暗室内压片1分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间获取最佳信噪比图片。或直接分别压片 30 秒、1、3、5分钟，然后一起显影定影观察结果。
2) 化学发光成像仪获取电子图片：将膜放置到成像仪内，参考仪器说明书设置合适的参数以获取优化图片。同时应根据靶蛋白的生物学性质如丰度等来调节成像参数。

附表1：BSA标准品稀释

1mg/ml BSA(μl)	稀释液(μl)	对应的蛋白含量（mg/ml）
0	20	0
1	19	0.05
2	18	0.1
4	16	0.2
8	12	0.4
12	8	0.6
16	4	0.8
20	0	1

附表2：分离胶浓度的选择

分子量（kDa)	分离胶浓度
X≤10	15%
10<X≤15	13.5%
15<X≤25	12%
25<X≤35	11%
35<X≤40	10%
40<X≤55	9%
55<X≤70	8%
70<X≤100	7%
100<X	6%

备注：X为目的蛋白大小

附表3：分离胶配制

分离胶浓度	6%	7%	8%	9%	10%	11%	12%	13.5%	15%
去离子水（mL）	5.3	4.9	4.6	4.3	4.0	3.65	3.3	2.8	2.3
30%丙烯酰胺（mL）	2	2.4	2.7	3.0	3.3	3.65	4.0	4.5	5.0
1.5M Tris-HCL(pH8.8) （mL）					2.5
10%SDS（mL）					0.1
10%AP（mL）					0.1
TEMED（mL）					0.01
总体积（mL）					10

附表4：5%浓缩胶配方

	5%浓缩胶	5%浓缩胶	5%浓缩胶	5%浓缩胶	5%浓缩胶
去离子水（mL）	1.1	2.1	2.7	3.4	4.1
30%丙烯酰胺（mL）	0.33	0.5	0.67	0.83	1.0
1.0M Tris-HCL(pH6.8) （mL）	0.25	0.38	0.5	0.63	0.75
10%SDS（mL）	0.02	0.03	0.04	0.05	0.06
10%AP（mL）	0.02	0.03	0.04	0.05	0.06
TEMED（mL）	0.002	0.003	0.004	0.005	0.006
总体积（mL）	2	3	4	5	6

附表5：转膜条件选择

分子量（kDa)	建议转膜条件（湿转）
X≤10	恒流200mA,30min
10<X≤15	恒流200mA,40min
15<X≤20	恒流200mA,50min
20<X≤50	恒流200mA, 1kDa/min+20min
50<X≤100	恒流200mA, 1kDa/min+30min
100<X≤150	恒流250mA, 1kDa/min+20min
150<X≤180	恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在3h内)
180<X	恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在4h内)

备注：X为目的蛋白大小以上为建议转膜条件，可根据使用转移设备的转膜效率、目的分子量大小等综合选择合适的转膜条件。针对大分子量或极小分子量蛋白，尤其注意需合理调整转膜液、转膜条件、转膜温度等问题。

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IHC-P

IHC-P免疫组织化学标准操作流程（石蜡切片——非磷酸化项目检测）

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

电磁炉、压力锅、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、光学显微镜、移液器、孵育湿盒、抗原修复盒。

2、实验试剂

(1) 缓冲液：0.01M PBS pH7.2±0.2; 0.01M pH7.2 PBST;
(2) 修复液（可选）：
pH6.0 0.01M柠檬酸修复液（1L）：C₆H₈O₇•H₂O 0.4g；NaC₆H₅O₇•2H₂O 3g；pH6.0；
pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液（1L）：C₄H₁₁NO₃ 1.21g；C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈•2H₂O 0.37g；pH9.0。
(3) 3%过氧化氢（需新鲜配制，30% H₂O₂与dH₂O体积比1:9）;
(4) 抗体稀释液：1X PBS + 5% 正常血清 + 0.3% Triton™ X-100;
(5) EnVision Systems检测体系, HRP显色系统： HRP RABBIT/MOUSE及配套DAB显色液;
(6) 脱蜡液、无水乙醇（分析纯）、去离子水（dH₂O）、苏木素、中性树胶封片剂。

二、实验步骤

1．脱蜡、水化：

（1）烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入65℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入65℃的恒温箱中；
（2）脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、95%乙醇、80%乙醇的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟

注意：流水清洗时水流不能直接对着切片；操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。

2．内源性过氧化物酶灭活：

将切片完全浸入到3%双氧水溶液中，室温，孵育10分钟；完成后流水清洗5分钟。

注意：内源性酶含量高的组织，可以延长灭活时间至15-20分钟；双氧水需新鲜配制，可提前5-10分钟配制3%的双氧水。

3．抗原修复（可选）：

（1）方法一，低pH值高压热修复：在高压锅中，加入pH6.0柠檬酸抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时3分钟；计时结束后离开热源，自来水冲洗（约15s），安全阀降落后开盖，待修复液温度降至室温后，用缓冲液PBST洗涤3次，每次1min。
（2）方法二，高pH值高压热修复：在高压锅中，加入pH9.0 EDTA抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时2分钟；计时结束后离开热源，自来水冲洗（约15s），安全阀降落后开盖，待修复液温度降至室温后，用缓冲液PBS洗涤3次，每次1min。

注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；修复液可根据实验需求自行选用修复液；修复时间可根据组织前处理状态适当调整。

4．染色：

（1）擦干组织周围水分，用免疫组化疏水笔在组织周围划圈，PBST洗涤2次，每次1min。
（2）一抗孵育：甩干组织周围水分，在组织切片上滴加已稀释的一抗，水平放置于孵育湿盒中，于室温（25℃）孵育1.5小时；
（3）洗涤：去除抗体工作液，用缓冲液PBST洗涤3次，每次5分钟；
（4）二抗孵育：甩干组织周围水分，在组织切片上滴加二抗工作液，水平放置于孵育湿盒中，于室温（25℃）孵育30分钟；
（5）洗涤：去除切片上的二抗工作液，用缓冲液PBST洗涤3次，每次5分钟；
（6）显色：显色前5分钟，配置DAB显色工作液，C液:B液体积比1:50，充分混匀；在组织切片上滴加显色工作液，室温（25℃）孵育8分钟；
（7）洗涤：将切片浸入大量dH2O中即可终止显色，流水冲洗2分钟；
（8）复染：将切片浸入苏木素中浸泡20秒，再用流水清洗2分钟；
（9）返蓝：将切片浸入氨水中浸泡2min，返蓝2min，再用流水清洗2分钟。

注意：染色过程中需一直保持切片处于湿润状态；染色过程中所有试剂使用过程中均需保证完全覆盖切片上组织；不同二抗及检测系统敏感性不同，因此对应一抗最佳稀释比可能会有差异；不同厂家苏木素复染程序略有不同。

5．脱水、透明、封片：

（1）脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡2次，每次1分钟；高温（55℃-60℃）下完全干燥；
（2）透明：将切片于二甲苯中浸入1次，每次1min；
（3）封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片。

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IF/ICC

免疫荧光实验操作流程（细胞样本）

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

4℃冰箱、恒温恒湿箱、通风橱、移液器、避光孵育湿盒。

2、实验试剂

(1) 缓冲液：0.01M pH7.2±0.2 TBS ；0.01M pH7.2±0.2 TBST
(2) 固定液：4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制）
(3) 抗体稀释液：1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
(4) 通透剂：0.3% Triton X-100（TBS缓冲液配制）
(5) 二抗（可选）：
使用兔源一抗可选二抗：
Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074；
Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073；
使用鼠源一抗可选二抗
Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077；
Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076；
(6) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制）
(7) 去离子水（dH₂O）、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1．样本前处理

(1) 弃去培养基，在细胞上缓慢加入常温TBS，清洗2次，每次5秒；
(2) 细胞固定：在细胞上覆盖 4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制），置于4℃，固定15min；固定液需足量；
(3) 固定液的清洗：去除固定液，使用4℃预冷的TBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟；
(4) 通透：对于细胞骨架，细胞器或细胞核定位蛋白，可增加通透步骤，使用冰甲醇冰上处理5-10min(可选)；

注意：需避免实验操作时温差过大或温度骤变；固定液需保证足量，可过量使用；甲醛有毒性，加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作。

2．染色步骤

（1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
（2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于4℃孵育过夜；
（3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
（4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
（5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2±0.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：TBS缓冲液体积比1:1000，避光，室温，孵育30分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
（6）细胞孔板可直接加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞涂片滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞爬片可取出，盖在滴加抗荧光衰减封片剂的载玻片上后，于荧光显微镜下观察并采集图像。

注意：实验中，所有试剂滴加应准确、快速、足量，不能出现干片的情况；染色步骤从二抗孵育开始，后续所有步骤都需注意避光操作；染色完成后需及时观察并采集图像，避免干燥和荧光物质淬灭。

免疫荧光实验操作流程（石蜡切片）

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、移液器、避光孵育湿盒、抗原修复盒。

2、实验试剂

(1) 缓冲液：0.01M pH7.2±0.2 TBS ；0.01M pH7.2±0.2 TBST
(2) 修复液（可选）：
pH6.0 0.01M柠檬酸修复液（1L）：C₆H₈O₇•H₂O 0.4g；NaC₆H₅O₇•2H₂O 3g；pH6.0；
pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液（1L）：C₄H₁₁NO₃ 1.21g；C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈•2H₂O 0.37g；pH9.0。
(3) 封闭液：5%空白山羊血清
(4) 抗体稀释液：1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
(5) 二抗：
使用兔源一抗可选二抗：
Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074；
Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073；
使用鼠源一抗可选二抗：
Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077；
Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076；
(6) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2±0.2 TBS配制）
(7) 去离子水（dH₂O）、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1．水化/脱蜡：

(1) 烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；
(2) 脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、95%乙醇的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟。

注意：流水清洗时水流不能直接对着切片；操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。

2．抗原修复：

（1）方法一，微波热修复：将切片浸入盛有修复液的修复盒中，将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上；整体放入微波炉中，高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；再高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；随后中低火加热1分钟后停火，微波炉内静置5分钟，然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。
注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开微波炉门；修复完成后不可快速冷却；修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
（2）方法二，高压热修复：在高压锅中，加入抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时3分钟；计时结束后离开热源，自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后，用缓冲液洗涤3次，每次1min。
注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。

3．染色：

（1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
（2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于4℃孵育过夜；
（3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
（4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
（5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：0.01M pH7.2 TBS缓冲液体积比1:1000，避光，室温，孵育30分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
（6）滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像。

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ABclonal公司的抗体，可以回收利用几次？

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实验方案

蛋白免疫印迹实验步骤

1、样品制备试剂

2、制胶试剂

3、电泳、转膜试剂及耗材

4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂

1、样品制备

2、凝胶电泳

3、转膜

4、封闭

5、抗体孵育

6、曝光

IHC-P免疫组织化学标准操作流程（石蜡切片——非磷酸化项目检测）

1、实验器材

2、实验试剂

1．脱蜡、水化：

2．内源性过氧化物酶灭活：

3．抗原修复（可选）：

4．染色：

5．脱水、透明、封片：

免疫荧光实验操作流程（细胞样本）

1、实验器材

2、实验试剂

1．样本前处理

2．染色步骤

免疫荧光实验操作流程（石蜡切片）

1、实验器材

2、实验试剂

1．水化/脱蜡：

2．抗原修复：

3．染色：

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