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KOValidated重组兔单抗

[KO Validated] N-Cadherin Rabbit mAb (A19083)

Western blot analysis of extracts from normal (control) and N-Cadherin knockout (KO) HeLa cells, using N-Cadherin antibody (A19083) at 1:1000 dilution.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25ug per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 1min.
Western blot analysis of extracts of various cell lines, using N-Cadherin antibody (A19083) at 1:1000 dilution.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25ug per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 1min.
Immunohistochemistry of paraffin-embedded mouse heart using N-Cadherin Rabbit mAb (A19083) at dilution of 1:100 (40x lens).
Immunohistochemistry of paraffin-embedded rat heart using N-Cadherin Rabbit mAb (A19083) at dilution of 1:100 (40x lens).
Immunofluorescence analysis of mouse heart using N-Cadherin Rabbit mAb (A19083) at dilution of 1:100 (40x lens). Blue: DAPI for nuclear staining.
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货号: A19083
促销价:   ¥1310.00
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产品内部验证

反应物种Human, Mouse, Rat
产品应用WBIHCIF
推荐稀释比
  • WB 1:500 - 1:2000
  • IHC 1:50 - 1:200
  • IF 1:50 - 1:200
理论分子量140kDa
实际分子量140kDa
存储缓冲液Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.
Buffer: PBS with 0.02% sodium azide,0.05% BSA,50% glycerol,pH7.3.
阳性样本HeLa,293T,NIH/3T3,C6
细胞定位Cell membrane,Single-pass type I membrane protein
纯化方式Affinity purification

抗原信息

免疫原A synthesized peptide derived from human N Cadherin
序列Email for sequence
进行序列比对

实验步骤

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实验步骤

蛋白质印迹法标准操作流程

一、实验试剂及耗材

1、样品制备试剂
  • a. RIPA 裂解液
  • b. 蛋白酶抑制剂
  • c. BCA工作液
  • d. BSA Standard Solution(5mg/ml)(RM00005)
  • e. 1×PBS缓冲液(RM00012)
  • d. 5×loading buffer(RM00001)
2、制胶试剂
  • a.30% Acr-Bis (29:1)(RM00006)
  • b.1 M Tris-HCl (pH6.8)(RM00003)
  • C.1.5M Tris-HCl (pH8.8)(RM00002)
  • d.10%SDS(RM00004)
  • e.10%Ammonium persulfate (APS)(RM00007)
  • f.TEMED(RM00009)
3、电泳、转膜试剂及耗材
  • a. 1X Tris-Glycine SDS Running Buffer(RM00010)
  • b. 1X Western Transfer Buffer(RM00011)
  • c. Filter Paper (7.5×10cm)(RM00019)
  • d. Nitrocellulose membrane(RM00017/ RM02801/ RM00018)
4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂
  • a. 1XTBST Buffer(RM00013)
  • b. 1X Western Blocking Buffer(RK05742)
  • c. Skimmed milk powder(RM00014)
  • d. Bovine Serum Albumin (BSA)(RM02802)
  • e. Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)
  • f. HRP 偶联二抗(AS014/AS003)
  • g. SignalFire™ ECL Reagent(RM00020/RM00021)

二、实验步骤

1、样品制备

(1)细胞收集

  • a. 贴壁培养细胞收集
    去除贴壁细胞的培养液,用PBS、NS或无血清培养基清洗1次,低速离心,弃上清,留取沉淀。
  • b. 悬浮培养细胞收集
    速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。手指轻弹细胞,使其松散。
  • c. 组织样本收集
    把组织剪切成细小的碎片,越小越好。取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织,迅速用液氮研磨,研磨过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。

(2)总蛋白提取

  • a. 细胞/组织裂解
    将装有细胞沉淀或组织碎片的容器完全插入冰中。细胞沉淀按照1mL裂解液/107个细胞(1个T75培养瓶细胞量)的比例加入相应体积的裂解液(细胞量足够时都加入3mL,不足时根据细胞量计算),裂解20min,每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s。组织碎片按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液,每3min研磨一次,重复5次,使组织尽量碾碎。(裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂)。
  • b. 离心
    把裂解好的样品配平后,置于预冷的高速冷冻离心机中,12000 rpm,15min。
  • c. 蛋白变性
    完成离心后,上清即为蛋白提取液。吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入1/4上清体积的5×Loading Buffer(最终工作液为1X),待干式恒温器温度升至95℃后,将1.5mL离心管插入加热孔中,95℃加热变性10min,待液体完全冷却后置于-20℃保存。

(3)蛋白浓度测定(BCA法)

  • a. BCA工作液的配置
    根据样品数量,按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B(50:1)配置适量BCA工作液,充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。
  • b. 标准品测定
    取10μl蛋白标准品(5mg/ml BSA)稀释至50μl,使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1*PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中,加稀释液补足到20μl(见附表)。加适当体积样品到96孔板的样品孔中,如果样本不足20μl,需加稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。各孔加入200μl BCA工作液,37℃放置20-30min。用酶标仪测定A562,或540-595nm之间的其他波长吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
2、凝胶电泳

(1)制胶器安装

  • 根据使用说明书安装。

(2)分离胶制备

  • 根据不同蛋白大小,选择不同浓度的分离胶(见附件表)。将制备好的胶溶液注入预先安装好的制胶器中,加入异丙醇封胶。室温水平放置30min左右。注意防止胶溶液产生气泡并注入制胶器中;注胶前再加入TEMED,防止注胶前凝固;注入异丙醇时需沿玻板一边缓慢拖动加入。

(3)浓缩胶制备

  • 分离胶凝固后,沿玻板一边倒出异丙醇,并用滤纸吸干。再根据需要的体积制备浓缩胶(见附表)。将制备好的胶溶液注入制胶器中,并把准备好的样品梳沿玻板一端缓慢插入胶溶液中,室温水平放置20-30min。注意样品梳与胶溶液之间避免气泡产生。

(4)上样

  • 待浓缩胶凝固好后,双手垂直拔出样品梳,并用Tris-Glycine SDS Running Buffer注入到内外槽中,形成闭合回路。用移液器吸取样品垂直梳孔上样,蛋白含量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满,外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm即可。

(5)电泳

  • 上样完以后,连通电泳仪电源,注意正负极需连接正确,设定适宜的电泳参数,浓缩胶电泳参数为恒压80V,待样本进入分离胶时,可将电泳调至120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时,停止电泳,关闭电泳仪电源。
3、转膜

(1)准备工作

  • a. 转膜缓冲液至少提前2h (即开始电泳后)放入-20℃冰箱预冷。
  • b. 根据胶体大小选择,将Filter Paper及Nitrocellulose membrane剪裁至合适尺寸。
  • c. 目的蛋白>20KD选择0.45μm NC膜;目的蛋白<20KD选择0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜,选择完毕后将NC膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用,注意如使用的是PVDF膜需先放入甲醇中浸泡5-10min,再放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

(2)转膜

  • 取出玻板中的凝胶,在夹板上依次放一块多孔垫、三张滤纸、凝胶、NC膜、三张滤纸、一块多孔垫(“三明治”结构),将转好的膜放在转膜槽,按一定的条件进行转膜。(见附表)
4、封闭
  • 将膜从“三明治”结构中取出,放入合适的抗体孵育槽中,加入Western Blocking Buffer室温孵育1h,一张6.3×8.3cm大小的膜加入6~7ml即可。
5、一抗孵育
  • a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
  • b. 封闭结束后,将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中,室温2h或4℃过夜。
6、洗涤
  • 一抗孵育结束后,加入TBST Buffer洗涤4次,5min/次。
7、二抗孵育
  • a. 一抗洗涤结束前10min,将二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
  • b. 洗涤结束后,将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中,室温1h。
8、洗涤
  • 二抗孵育结束后,加入TBST Buffer洗涤4次,5min/次。
9、曝光
  • a. 根据膜的大小,按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液,按比例吸取等体积的 SolutionⅠ和 SolutionⅡ混匀,配制成发光检测工作液。
  • b. 用平头镊子将膜取出,膜的下缘轻轻接触吸水纸,去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上,使其均有覆盖,室温孵育 1-2min,此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
  • c. 压片检测:将膜固定于片夹内。暗室内压片 1 分钟,立即显影定影,根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30 秒、1、3、 5 分钟,然后一起显影定影观察结果。
  • d. 荧光成像仪检测:将膜放置到荧光成像仪内,参考仪器说明书进行检测。

附表1:BSA标准品稀释

1mg/ml BSA(μl) 稀释液(μl) 对应的蛋白含量(mg/ml)
0 20 0
1 19 0.05
2 18 0.1
4 16 0.2
8 12 0.4
12 8 0.6
16 4 0.8
20 0 1

附表2:分离胶浓度的选择

分子量(kDa) 分离胶浓度
X≤10 15%
10<X≤15 13.5%
15<X≤25 12%
25<X≤35 11%
35<X≤40 10%
40<X≤55 9%
55<X≤70 8%
70<X≤100 7%
100<X 6%
备注:X为目的蛋白大小

附表3:分离胶配制

分离胶浓度 6% 7% 8% 9% 10% 11% 12% 13.5% 15%
去离子水(mL) 5.3 4.9 4.6 4.3 4.0 3.65 3.3 2.8 2.3
30%丙烯酰胺 (mL) 2 2.4 2.7 3.0 3.3 3.65 4.0 4.5 5.0
1.5M Tris-HCL(pH8.8) (mL) 2.5
10%SDS(mL) 0.1
10%AP(mL) 0.1
TEMED(mL) 0.01
总体积(mL) 10

附表4:浓缩胶配制

5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶
去离子水(mL) 1.1 2.1 2.7 3.4 4.1
30%丙烯酰胺 (mL) 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0
1.0M Tris-HCL(pH6.8) (mL) 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75
10%SDS(mL) 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
10%AP(mL) 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
TEMED(mL) 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006
总体积(mL) 2 3 4 5 6

附表5:转膜条件选择

分子量(kDa) 转膜条件
X≤10 恒流200mA,30min
10 < X≤15 恒流200mA,40min
15< X≤20 恒流200mA,50min
20< X≤50 恒流200mA, 1kDa/min+20min
50< X≤100 恒流200mA, 1kDa/min+30min
100< X≤150 恒流250mA, 1kDa/min+20min
150< X≤180 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在3h内)
180< X 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在4h内)
备注:X为目的蛋白大小

IP检测

一、实验试剂

  • (1)rProtein A/G Plus MagPoly Beads(RM09008)
  • (2)裂解液&洗杂液:Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)(RM00022)
  • (3)蛋白酶抑制剂
  • (4)封闭液:含 3% BSA 的 1X PBS
  • (5)1×PBS 缓冲液(RM00012)
  • (6)5×loding buffer(RM00001)(使用时用去离子水稀释至工作浓度即可)
  • (7)Control IgG (AC005/ AC011/AC034)

二、实验步骤

1、样本处理

(1)贴壁培养细胞

  • a. 取裂解液室温溶解混匀,根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
  • b. 去除贴壁细胞的培养液,用PBS、NS或无血清培养基清洗1次,低速离心,弃上清,留取沉淀。
  • c. 按照6孔板每孔加入100~200μl裂解液的比例,加入裂解液。移液器轻轻吹打,使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液作用于细胞1~5s内,细胞会被裂解。
  • d. 1000~12000g,离心3~5min(如果用冷冻离心机4℃效果更佳),取上清。

(2)悬浮培养细胞

  • a. 取裂解液室温溶解混匀,根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
  • b. 速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。
  • c. 手指轻弹细胞,使其松散。按照6孔板每孔加入100~200μl裂解液的比例,加入NP-40裂解液。通常6孔板每孔加入100~200μl裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量150~200μl,再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应无明显沉淀。
  • d. 1000~12000g,离心3~5min(如果用冷冻离心机4℃效果更佳),取上清。

(3)组织样本

  • a. 取裂解液室温溶解混匀,根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
  • b. 把组织剪切成细小的碎片,越小越好。
  • c. 取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织,迅速用液氮研磨,研磨过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。
  • d. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例,加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30-60min。(步骤3、4也可采用以下过程:按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例加入NP-40裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆,直至充分裂解,过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。)
  • e. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例,加入裂解液。
  • f. 1000~12000g,4℃离心10~15min(如无低温离心机,室温下离心也可),取上清。
2、磁珠预处理
  • (1)将rProtein A/G Plus MaqPoly Beads颠倒或漩涡混匀,翻转瓶身发现底部无黑色沉淀即可。
  • (2)取30μl rProtein A/G Plus MaqPoly Beads至新的EP管中,放在磁分离器上,待溶液澄清后,用移液器吸弃保护液。
  • (3)将EP管从磁分离器上取下来,加入1ml Cell lysis buffer for IP (without inhibitors),混匀,放置在磁分离器上,收集磁珠,用移液器吸弃洗杂液,重复2次。
  • (4)将EP管从磁分离器上取下来,加入1mL的3% BSA,置于翻转混合仪4℃封闭1h.
  • (5)重复步骤3),备用。
3、磁珠、抗原-抗体复合物结合
  • (1)将含有抗原的样品(通常300μl-1000μl,抗原量200μg)中加入目标抗体(通常3μg),置于翻转混合仪4℃下反应2h或过夜。
  • (2)将上述完成抗体-抗原结合的复合物与备用好的磁珠进行混合,置于4℃下反应2h或过夜。
  • (3)将上述磁珠-抗体-抗原复合物放在磁分离器上进行分离,收集上清液,以备后续检测。
  • (4)向离心管中加入1ml洗杂液,用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散,然后进行磁性分离,弃上清液;从磁分离器上取下离心管,重复洗涤两次。
4、抗原洗脱

(1)变性洗脱(此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。)

  • a. 从磁分离器上取下离心管,向其中加入30μl 2X SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀,95℃加热15min。
  • b. 置于磁性分离器上进行磁性分离,收集上清液进行SDS-PAGE检测。

(2)非变性洗脱

  • a. 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入50μl洗脱液,混合均匀,室温孵育5min。
  • b. 置于磁性分离器上进行磁性分离,收集洗脱液至新的EP管中。
  • c. 重复步骤1)和2),收集洗脱液,与2)中洗脱液混合,加入中和液中和至pH7.0-8.0。用于后期功能分析。

ChIP标准操作流程

一、实验试剂

  • (1)PBS缓冲液(RM00012)
  • (2)TE 缓冲液
  • (3)甲醛:40%
  • (4)甘氨酸:20%
  • (5)Lysis Buffer
  • (6)Dilution buffer
  • (7)Wash buffer I
  • (8)Wash buffer II
  • (9)Wash buffer III
  • (10)Elution buffer
  • (11)rProtein A/G Plus MagPoly Beads(RM09008)

二、实验步骤

1、细胞裂解
  • (1)取1x107细胞,加入1ml PBS和25ul甲醛(40%)混匀后,于冰上放置10min(混匀2-3次)。
  • (2)加入50ul甘氨酸(20%),混匀后静置5min。
  • (3)3000rpm离心5min,用1ml PBS清洗2遍。
  • (4)加入200ul Lysis Buffer(含10ul蛋白酶抑制剂),置于旋转摇床4℃裂解30min。
  • (5)加入800ul Dilution buffer,混匀后超声15-20min。
  • (6)12000rpm离心10min取上清,吸取少量裂解液DNA回收检测。
  • (7)琼脂糖电泳检测DNA打断程度,DNA长度应在150-900 bp之间。
  • (8)使用Qubit™荧光定量仪检测染色质浓度。
注意:整个过程在低温下进行,超声条件根据检测结果进行调整。
2、IP(免疫沉淀:磁珠法):
  • (1)取60ul 磁珠加入1ml BSA(1mg/ml,TE缓冲液配制),于旋转摇床4℃旋转5min,至于磁力架弃去液体,加入1ml BSA重复此操作1次。
  • (2)加入1ml TE溶液清洗磁珠两次,于4℃放置备用。
  • (3)取180ul染色质裂解液,加入320ul Dilution buffer(一份IP样品), 分别加入5ul抗体,1ul Normal Rabbit IgG,5ul Histone H3于4℃过夜,然后加入60ul处理好的磁珠,4℃孵育2h。
  • (4)依次使用Wash buffer I/II/III 洗涤磁珠,完成后使用TE溶液洗涤两次。
  • (5)弃去上清后加入200ul Elution buffer,置于旋转摇床室温旋转10min。
  • (6)吸取上清加入10ul蛋白酶K,65℃水浴至少4h。
  • (7)使用DNA回收试剂盒回收DNA。
注意:每份IP样本应含DNA的量为7-10ug DNA(转录因子15-20ug),抗体加入量为3-5ug,可根据实验进行优化。
3、Q-PCR:

(1)反应体系 (20ul)

DNA模板: 5 μl
引物: 5 μl
Green Master Mix: 10 μl

(2)反应体系 (20ul)

Stage 1 预变性 Reps: 1 95 ℃ 5 min
Stage 2 循环反应 b Reps: 40 95 ℃ 10 sec
60 ℃ 30 sec
Stage 3 融解曲线 Reps: 1 95 ℃ 15 sec
60 ℃ 60 sec
95 ℃ 15 sec
4、结果计算

假设 Input 起始浓度为 a,Ct1 个循环数扩增后达到阈值;IgG 起始浓度为 b,Ct2 个循环数扩增后达到阈值;目的蛋白起始浓度为 c,Ct3 个循环数扩增后达到阈值。则可以得到如下公式:

a×2Ct1 = b×2Ct2 = c×2Ct3
b/a = 2Ct1/2Ct2 = 2(Ct1-Ct2) b:a=2(Ct1-Ct2)
c/a = 2Ct1/2Ct3 = 2(Ct1-Ct3) c:a=2(Ct1-Ct3)
检测结果=2(Ct1-Ct3)/2(Ct1-Ct2)

Dot Blot检测标准操作流程.

一、实验仪器试剂和耗材

  • (1)Blocking Buffer(RK05742)
  • (2)Antibody Dilution Buffer(RK05743)
  • (3)TBST Buffer(RM00013)
  • (4)HRP 偶联二抗(AS014,AS003)
  • (5)SignalFire™ ECL Reagent(RM00020/RM00021)
  • (6)Nitrocellulose membrane (0.45μm)(RM00017)

二、实验步骤

1、膜的准备

Dot Blot检测采用NC膜,取NC膜裁成6.5cm宽长条,并在其上画长宽为1cm×1cm正方形小格(在膜上面的蓝色纸上画,画格时膜(白色)与蓝色纸必须完全重叠,让蓝色纸上的正方形小格能在膜上留下正确的划痕)。

2、多肽稀释

将不同浓度的多肽稀释为成50ng/ul(稀释为需要的浓度即可)。

3、多肽包被

揭开膜上面的蓝色保护纸,用移液器吸取50ng/μL多肽稀释液2ul点在膜上1cm×1cm正方形小格中心,即多肽包被量为100ng(包被量根据需求调整)。点样完成后,将NC膜放入37℃烘箱中30min。

4、封闭

把膜放入相应的大小的抗体孵育容器中,加入适量Blocking Buffer室温封闭1h。

5、一抗孵育

封闭结束10min前,用Antibody Dilution Buffer稀释一抗备用。封闭结束后去除封闭液,加入稀释好的一抗工作液,室温2h或4℃过夜。

6、洗涤

去除一抗工作液,加入适量TBST Buffer洗杂4次,5min/次。

7、二抗孵育

洗杂结束前10min,用Antibody Dilution Buffer稀释二抗备用。去除TBST Buffer,加入稀释好的二抗工作液,室温1h。

8、洗涤

去除二抗工作液,加入适量TBST Buffer洗杂4次,5min/次。

9、曝光
  • a. 根据膜的大小,按1cm*1cm的膜使用 20ul工作液,按比例吸取等体积的 SolutionⅠ和 SolutionⅡ混匀,配制成发光检测工作液。
  • b. 用平头镊子将膜取出,膜的下缘轻轻接触吸水纸,去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上,使其均有覆盖,室温孵育 1-2min,此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
  • c. 压片检测:将膜固定于片夹内。暗室内压片 1 分钟,立即显影定影,根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30 秒、1、3、 5 分钟,然后一起显影定影观察结果。
  • d. 荧光成像仪检测:将膜放置到荧光成像仪内,参考仪器说明书进行检测。

免疫组织化学标准操作流程(石蜡切片——非磷酸化项目检测)

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、光学显微镜、移液器、孵育湿盒、抗原修复盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液:0.01M PBS pH7.2±0.2; 0.01M pH7.2 PBST;
    试剂名称 1*PBS/L 试剂名称 1*PBST/L
    NaH2PO4 0.23g 1*PBS溶液 1L
    Na2HPO4 1.15g Tween 20 溶液 0.001L
    NaCl 8.5g 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
  • (2) 修复液(可选):
    pH6.0 0.01M柠檬酸修复液(1L):C6H8O7•H2O 0.4g;NaC6H5O7•2H2O 3g;pH6.0;
    pH7.0 0.01M PBS修复液(1L):KH2PO4 0.07g;NaCl 7.89g;Na2HPO4 0.45g;KCl 0.10g;pH7.2-7.4;
    pH8.0 0.05M Tris-EDTA修复液(1L):C4H11NO3 6.05g;C10H14N2Na2O8•2H2O 0.29g;用稀HCl调至pH8.0;
    pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液(1L):C4H11NO3 1.21g;C10H14N2Na2O8•2H2O 0.37g;pH9.0。
  • (3) 封闭液:5%空白山羊血清;
  • (4) 3%过氧化氢(需新鲜配制,30% H2O2与dH2O体积比1:9);
  • (5) 抗体稀释液:1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100;
  • (6) EnVision Systems检测体系, HRP显色系统: HRP RABBIT/MOUSE及配套DAB显色液;
  • (7) 脱蜡液、无水乙醇(分析纯)、去离子水(dH2O)、Mayer’s苏木素、中性树胶封片剂。

二、实验步骤

1.水化/脱蜡:
  • (1)烤片:将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上,将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟;同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中;
  • (2)脱蜡至水:将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温,5分钟后,将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中,并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中,每缸5分钟;用流水清洗切片5分钟。
注意:流水清洗时水流不能直接对着切片;操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
2.内源性过氧化物酶灭活:
  • 将切片完全浸入到3%双氧水溶液中,室温,孵育10分钟;完成后流水清洗5分钟。
注意:内源性酶含量高的组织,可以延长灭活时间至15-20分钟;双氧水需新鲜配制,可提前5-10分钟配制3%的双氧水。
3.抗原修复(可选):
  • (1)方法一,微波热修复:将切片浸入盛有修复液的修复盒中,将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上;整体放入微波炉中,高火加热3分钟后停火,微波炉内静置5分钟;再高火加热3分钟后停火,微波炉内静置5分钟;随后中低火加热1分钟后停火,微波炉内静置5分钟,然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。待修复液温度降至室温后,用缓冲液PBS洗涤3次,每次1min。
  • (2)方法二,高压热修复:在高压锅中,加入抗原修复液,高火预热;待修复液沸腾后将切片置于其中,并完全浸泡组织,盖好锅盖,扣上压力阀,高火继续加热;待限压阀开始转动喷气后调至中火,同时开始计时2分钟;计时结束后离开热源,自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后,用缓冲液PBS洗涤3次,每次1min。
注意:修复液需完全浸没切片上组织;修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序;修复完成后避免快速冷却;修复液可根据实验需求自行选用修复液。
4.染色:
  • (1)封闭:待修复液温度降至室温后,从修复盒中取出切片;用缓冲液PBS清洗切片2次,每次3分钟;去除切片上的缓冲液;在组织切片上滴加5%空白山羊血清封闭液;将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中,于37℃恒温孵育30分钟;
  • (2)一抗孵育:去除封闭液,在组织切片上滴加用缓冲液PBS稀释的一抗,水平放置于孵育湿盒中,于4℃孵育过夜;
  • (3)复温:将孵育湿盒取出室温复温15-30分钟,去除抗体工作液,用缓冲液PBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液PBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (4)二抗孵育:在组织切片上滴加二抗工作液后水平放置于孵育湿盒中,于37℃恒温孵育1h;
  • (5)去除切片上的溶液,用缓冲液PBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液PBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (6)显色:显色前5分钟,配置DAB显色工作液,C液:B液体积比1:100,充分混匀;在组织切片上滴加显色工作液,显微镜下密切观察颜色变化情况,通常10-60秒即可得到合适的染色强度;将切片浸入大量dH2O中即可终止显色;
  • (7)复染、返蓝:将切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片,用流水清洗10分钟。
注意:染色过程中需一直保持切片处于湿润状态;染色过程中所有试剂使用过程中均需保证完全覆盖切片上组织。
5.脱水、封片:
  • (1)脱水:将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次,10秒;高温(55℃-60℃)下完全干燥;
  • (2)封片:在切片中心滴加适量中性树胶,并加盖盖玻片。

免疫荧光实验操作流程(细胞样本)

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

4℃冰箱、恒温恒湿箱、通风橱、移液器、避光孵育湿盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液:0.01M pH7.2±0.2 TBS ;0.01M pH7.2±0.2 TBST
    试剂名称 1*TBS/L 试剂名称 1*TBST/L
    Tris 1.21g 1*TBS 1L
    NaCl 8.8g Tween 20 溶液 0.001L
    用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
  • (2) 固定液:4%中性甲醛固定液(TBS缓冲液配制)
  • (3) 抗体稀释液:1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
  • (4) 通透剂:0.3% Triton X-100(TBS缓冲液配制)
  • (5) 二抗(可选):
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074;
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073;
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077;
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076;
  • (6) 染核试剂:1mg/mL DAPI(用时使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制)
  • (7) 去离子水(dH2O)、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1.样本前处理
  • (1) 弃去培养基,在细胞上缓慢加入常温TBS,清洗2次,每次5秒;
  • (2) 细胞固定:在细胞上覆盖 4%中性甲醛固定液(TBS缓冲液配制),置于4℃,固定15min;固定液需足量;
  • (3) 固定液的清洗:去除固定液,使用4℃预冷的TBS缓冲液,漂洗3次,每次5分钟;
注意:需避免实验操作时温差过大或温度骤变;固定液需保证足量,可过量使用;甲醛有毒性,加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作。
2.染色步骤
  • (1)封闭:用5%空白山羊血清将样本完全覆盖,切片需放置于湿盒内,细胞孔板可直接将孔板密封好,置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min;
  • (2)一抗孵育:去除封闭液,直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液,样本需完全覆盖,切片需放置于湿盒内,细胞孔板可直接将孔板密封好,置于4℃孵育过夜;
  • (3)复温:将样本置于常温,复温15min,去除抗体工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (4)二抗孵育:在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液,样本需完全覆盖,避光,37℃,孵育1小时;去除二抗工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (5)染核:在样本上滴加DAPI工作液,使用0.01M pH7.2±0.2 TBS缓冲液配制,DAPI溶液:TBS缓冲液体积比1:500,避光,室温,孵育10分钟;去除DAPI工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (6)细胞孔板可直接加入抗荧光衰减封片剂后,于荧光显微镜下观察并采集图像;细胞涂片滴加抗荧光衰减封片剂,然后加盖盖玻片封片,再于荧光显微镜下观察并采集图像;细胞爬片可取出,盖在滴加抗荧光衰减封片剂的载玻片上后,于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意:实验中,所有试剂滴加应准确、快速、足量,不能出现干片的情况;染色步骤从二抗孵育开始,后续所有步骤都需注意避光操作;染色完成后需及时观察并采集图像,避免干燥和荧光物质淬灭。

免疫荧光实验操作流程(石蜡切片)

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、移液器、避光孵育湿盒、抗原修复盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液:0.01M pH7.2±0.2 TBS ;0.01M pH7.2±0.2 TBST
    试剂名称 1*TBS/L 试剂名称 1*TBST/L
    Tris 1.21g 1*TBS 1L
    NaCl 8.8g Tween 20 溶液 0.001L
    用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
  • (2) 修复液(可选):
    pH6.0 0.01M柠檬酸修复液(1L):C6H8O7•H2O 0.4g;NaC6H5O7•2H2O 3g;pH6.0;
    pH7.0 0.01M PBS修复液(1L):KH2PO4 0.07g;NaCl 7.89g;Na2HPO4 0.45g;KCl 0.10g;pH7.2-7.4;
    pH8.0 0.05M Tris-EDTA修复液(1L):C4H11NO3 6.05g;C10H14N2Na2O8•2H2O 0.29g;用稀HCl调至pH8.0;
    pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液(1L):C4H11NO3 1.21g;C10H14N2Na2O8•2H2O 0.37g;pH9.0。
  • (3) 封闭液:5%空白山羊血清
  • (4) 抗体稀释液:1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
  • (5) 二抗:
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074;
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073;
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077;
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076;
  • (6) 染核试剂:1mg/mL DAPI(用时使用0.01M pH7.2±0.2 TBS配制)
  • (7) 去离子水(dH2O)、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1.水化/脱蜡:
  • (1) 烤片:将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上,将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟;同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中;
  • (2) 脱蜡至水:将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温,5分钟后,将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中,并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中,每缸5分钟;用流水清洗切片5分钟。
注意:流水清洗时水流不能直接对着切片;操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
2.抗原修复:
  • (1)方法一,微波热修复:将切片浸入盛有修复液的修复盒中,将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上;整体放入微波炉中,高火加热3分钟后停火,微波炉内静置5分钟;再高火加热3分钟后停火,微波炉内静置5分钟;随后中低火加热1分钟后停火,微波炉内静置5分钟,然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。
    注意:修复液需完全浸没切片上组织;修复过程中严禁打开微波炉门;修复完成后不可快速冷却;修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
  • (2)方法二,高压热修复:在高压锅中,加入抗原修复液,高火预热;待修复液沸腾后将切片置于其中,并完全浸泡组织,盖好锅盖,扣上压力阀,高火继续加热;待限压阀开始转动喷气后调至中火,同时开始计时2分钟;计时结束后离开热源,自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后,用缓冲液洗涤3次,每次1min。
    注意:修复液需完全浸没切片上组织;修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序;修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
3.染色:
  • (1)封闭:用5%空白山羊血清将样本完全覆盖,切片需放置于湿盒内,置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min;
  • (2)一抗孵育:去除封闭液,直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液,样本需完全覆盖,切片需放置于湿盒内,置于4℃孵育过夜;
  • (3)复温:将样本置于常温,复温15min,去除抗体工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (4)二抗孵育:在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液,样本需完全覆盖,避光,37℃,孵育1小时;去除二抗工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (5)染核:在样本上滴加DAPI工作液,使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制,DAPI溶液:0.01M pH7.2 TBS缓冲液体积比1:500,避光,室温,孵育10分钟;去除DAPI工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (6)滴加抗荧光衰减封片剂,然后加盖盖玻片封片,再于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意:实验中,所有试剂滴加应准确、快速、足量,不能出现干片的情况;染色步骤从二抗孵育开始,后续所有步骤都需注意避光操作;染色完成后需及时观察并采集图像,避免干燥和荧光物质淬灭。

靶点背景信息

This gene encodes a classical cadherin and member of the cadherin superfamily. Alternative splicing results in multiple transcript variants, at least one of which encodes a preproprotein is proteolytically processed to generate a calcium-dependent cell adhesion molecule and glycoprotein. This protein plays a role in the establishment of left-right asymmetry, development of the nervous system and the formation of cartilage and bone. [provided by RefSeq, Nov 2015]

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