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Western blot analysis of lysates from wild type (WT) and N-Cadherin knockout (KO) HeLa cells, using [KO Validated] N-Cadherin Rabbit mAb (A19083) at 1:1000 dilution.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25μg per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 1min.

Western blot analysis of various lysates using [KO Validated] N-Cadherin Rabbit mAb (A19083) at 1:1000 dilution.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25μg per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 1min.

Immunohistochemistry analysis of N-Cadherin in paraffin-embedded human liver tissue using [KO Validated] N-Cadherin Rabbit mAb (A19083) at a dilution of 1:200 (40x lens).High pressure antigen retrieval was performed with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) prior to IHC staining.

Immunohistochemistry analysis of N-Cadherin in paraffin-embedded mouse heart tissue using [KO Validated] N-Cadherin Rabbit mAb (A19083) at a dilution of 1:200 (40x lens).High pressure antigen retrieval was performed with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) prior to IHC staining.

Immunohistochemistry analysis of N-Cadherin in paraffin-embedded rat heart tissue using [KO Validated] N-Cadherin Rabbit mAb (A19083) at a dilution of 1:200 (40x lens).High pressure antigen retrieval was performed with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) prior to IHC staining.

Immunohistochemistry analysis of N-Cadherin in paraffin-embedded rat liver tissue using [KO Validated] N-Cadherin Rabbit mAb (A19083) at a dilution of 1:200 (40x lens).High pressure antigen retrieval was performed with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) prior to IHC staining.

Confocal imaging of paraffin-embedded rat heart using [KO Validated] N-Cadherin Rabbit mAb (A19083, dilution 1:200) followed by a further incubation with Cy3 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS007, dilution 1:500) (Red). DAPI was used for nuclear staining (Blue). Objective: 40x.Perform high pressure antigen retrieval with 0.01M citrate buffer (pH 6.0) prior to IF staining.

Confocal imaging of paraffin-embedded Mouse heart using [KO Validated] N-Cadherin Rabbit mAb (A19083, dilution 1:200) followed by a further incubation with Cy3 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS007, dilution 1:500) (Red). DAPI was used for nuclear staining (Blue). Objective: 40x.Perform high pressure antigen retrieval with 0.01M citrate buffer (pH 6.0) prior to IF staining.

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货号: A19083
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详细信息

推荐稀释比
  • WB1:500 - 1:2000
  • IHC-P1:50 - 1:200
  • IF/ICC1:50 - 1:200
浓度查询

请输入产品标签上的lot号,例如4000000001

反应物种
Human, Mouse, Rat
同种型
IgG
理论分子量
100kDa
实际分子量
140kDa
克隆号
ARC0371
产品形式
Liquid
偶联物
Unconjugated
存储缓冲液
Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.
Buffer: PBS with 0.02% sodium azide,0.05% BSA,50% glycerol,pH7.3.
阳性样本
HeLa,293T,NIH/3T3,C6
细胞定位
Cell membrane,Single-pass type I membrane protein
纯化方式
Affinity purification

抗原信息

免疫原
A synthetic peptide corresponding to a sequence within amino acids 100-200 of human N Cadherin (P19022).
序列
AKFLIYAQDKETQEKWQVAVKLSLKPTLTEESVKESAEVEEIVFPRQFSKHSGHLQRQKRDWVIPPINLPENSRGPFPQELVRIRSDRDKNLSLRYSVTGP

用户验证的应用

应用及物种
  • WB (Mus musculus , Homo sapiens , Rattus norvegicus , Sus scrofa , homo sapiens)
  • IHC (Homo sapiens , Mus musculus)
  • IF (Homo sapiens)
  • IP (Homo sapiens)

背景信息

This gene encodes a classical cadherin and member of the cadherin superfamily. Alternative splicing results in multiple transcript variants, at least one of which encodes a preproprotein is proteolytically processed to generate a calcium-dependent cell adhesion molecule and glycoprotein. This protein plays a role in the establishment of left-right asymmetry, development of the nervous system and the formation of cartilage and bone.

关联靶点

CDH2为关键词搜索文献记录,得到上述基因与CDH2的研究紧密相关,排序顺序根据研究相关程度由高到低决定。(所显示数字代表两者共同出现的已发表文献数量)
1/

关联领域

CDH2为关键词搜索文献记录,得到上述相关热词信息,可反映出CDH2的研究趋势与热点。(关联领域与基因名称的距离代表其研究热度)

* 该数据来源于赛特新思(citexs.com)
来自于发表文献,仅供参考所用,ABclonal不承担任何责任。

暂无以CDH2为关键词搜索的文献记录。

该服务由赛特新思提供,上述关联分析来自已发表文献,仅供参考所用,ABclonal不承担任何责任。

ABclonal公司的抗体,可以回收利用几次?

首先,一般抗体不推荐客户回收利用,抗体使用之后缓冲体系已经发生改变,不同客户在回收抗体的保存条件上也会有差异,所以抗体回收使用效果无法保证。另外,ABclonal公司也做过一批抗体回收验证测试,测试结果显示不同抗体可回收次数不同,一般效价越高的抗体,可重复使用的次数越多,客户可根据实验情况来确定。
注:我们将孵育完毕后剩余的抗体回收到离心管中置于4℃保存,效价高的抗体可至少保存1周,至少重复利用3次。

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ABclonal作为国产抗体品牌的优势?

武汉爱博泰克生物(ABclonal)科技有限公司是国产品牌,她成立于2011年,公司依托ABclonal美国波士顿抗体与蛋白研发中心、中国光谷生物城(武汉)抗体生产基地以及上海张江分子酶研发中心,凝聚了十余位来自哈佛大学、麻省理工、复旦大学、上海交大、中科院生化细胞所和武汉大学的全球知名分子和免疫学方面博士,组成我们的科学家团队,通过聚焦抗体与酶核心技术,致力于打破国际技术的垄断,将公司打造成为科研工具和诊断原料的国内领导品牌,乃至弯道超越国际巨头。 我们拥有包括兔多克隆抗体、小鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体的生产研发平台,同时也有包括WB,IHC,IF,IP,CHIP在内的检测平台,我们对每一支自产的抗体进行了严格的检测。当然,我们部分直销地区也可以帮客户代购进口品牌的产品。同时也有抗体定制服务。ABclonal抗体优势:1,严自检,保质量;2产品多,指标全;3,价格低,货期短。注:ABclonal抗体价格体系详情见附件

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ABclonal抗体成分?

ABclonal抗体成分在平时工作当中,常会有客户咨询我们的抗体用的什么buffer进行保存,一般来说,我们的buffer的成分是:PBS含0.03%的proclin300、0.05%牛血清白蛋白、50%甘油;也有一些是PBS含0.03%的proclin300,50%甘油。防腐剂 Proclin 300活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)。ProClin生物灭活剂能够迅速穿透细胞膜,抑制对细胞呼吸至关重要的特定酶,因此一接触微生物有机体就会立即抑制细胞活性。ProClin的多个特定毒性位点可以防止微生物产生高水平的耐药性。

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实验方案

折叠内容
WB

蛋白免疫印迹实验步骤

一、实验仪器及试剂

1、样品制备试剂
  • a. RIPA 裂解液
  • b. 蛋白酶抑制剂
  • c. BCA工作液
  • d. BSA Standard Solution(5mg/ml)(RM00005)
  • e. 1×PBS缓冲液(RM00012)
  • f. 5×loading buffer(RM00001)
2、制胶试剂
  • a.30% Acr-Bis (29:1)(RM00006)
  • b.1 M Tris-HCl (pH6.8)(RM00003)
  • C.1.5M Tris-HCl (pH8.8)(RM00002)
  • d.10% SDS(RM00004)
  • e.10% Ammonium persulfate (APS)(RM00007)
  • f.TEMED(RM00009)
3、电泳、转膜试剂及耗材
  • a. 1X Tris-Glycine SDS Running Buffer(RM00010)
  • b. 1X Western Transfer Buffer(RM00011)
  • c. Filter Paper (7.5×10cm)(RM00019)
  • d. Nitrocellulose membrane(RM00017/ RM02801/ RM00018)
4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂
  • a. 1XTBST Buffer(RM00013)
  • b. 1X Western Blocking Buffer(RK05742)
  • c. Skimmed milk powder(RM00014)
  • d. Bovine Serum Albumin (BSA)(RM02802)
  • e. Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)
  • f. HRP 偶联二抗(根据一抗情况选用,AS014/AS003等可供选择)
  • g. SignalFire™ ECL Reagent(RM00020/RM00021)

二、实验步骤

1、样品制备

(1)细胞收集

  • a. 贴壁培养细胞收集
    用细胞刮刮下细胞或用胰酶消化处理后,400×g,离心5 min,弃上清;用适量冰PBS溶液将离心后细胞沉淀重悬,4℃,400×g 离心5min,弃上清,重复清洗步骤一次收集细胞沉淀。
  • b. 悬浮培养细胞收集
    收集悬浮细胞,400×g离心5min,弃上清,适量冰PBS溶液将离心后细胞沉淀重悬,4℃,400×g 离心5min,弃上清,重复清洗步骤一次,收集细胞沉淀。
  • c. 组织样本收集
    把组织在预冷的表面上剪切成细小碎块,然后用液氮或超低温冰箱中冷冻组织30min以上,迅速加液氮研磨,研磨过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。

(2)总蛋白提取

  • a. 细胞/组织裂解:
    根据收集的细胞数量、细胞种类添加适量的裂解液。
    例如常规细胞沉淀可按照1mL裂解液/107个细胞的比例加入相应体积的裂解液,加入裂解液后将沉淀吹打混匀。使用细胞破碎仪超声样本,每次超声时间4-5s,间隔时间在5s左右,肉眼观察,样本为均一,不粘稠液体即可。或采用震荡裂解方式进行,每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s,裂解20min。
    组织碎片可按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液,每3min研磨一次,重复5次,使组织尽量碾碎(裂解液中根据需要添加或不添加蛋白酶抑制剂)。所有理解过程,务必在低温条件下进行。
  • b. 离心:
    把裂解好的样品配平后,将裂解好的样本置于预冷的高速冷冻离心机中,13000×g离心10min,收集上清
  • c. 蛋白变性:
    吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入对应体积的5× Loading Buffer(最终工作液为1×),待干式恒温器温度升至95℃后,将1.5mL离心管插入加热孔中,95℃加热变性10min,待液体完全冷却后置于-20℃保存。

(3)蛋白浓度测定(BCA法)

  • a. BCA工作液的配置
    根据样品数量,按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B(50:1)配置适量BCA工作液,充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。
  • b. BSA标准品梯度稀释
    取10μl蛋白标准品(5 mg/mL BSA)稀释至50μl,使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1×PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中,加稀释液补足到20μl。
  • c. 样本浓度测定
    加适当体积样品到96孔板的样品孔中,如果样本不足20μl,需加稀释液补足到20μl。每孔加入 200μl BCA工作液,37℃放置20-30min。用酶标仪测定样本和标准品在562nm下的吸光度,或在540-595nm之间波长下的吸光度。根据BSA蛋白浓度标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
2、凝胶电泳

(1)制胶器安装

  • 根据使用说明书安装。

(2)凝胶配置

  • 根据目标蛋白大小,选择不同合适浓度的分离胶(见附表)。注意该过程注意不能有气泡产生。

(3)上样

  • 待胶凝固好后,用移液器吸取样品垂直梳孔上样,建议总蛋白上样量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满,外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm即可。

(4)电泳

  • 上样完成后,连通电泳仪电源,注意正负极需连接正确,设定适宜的电泳参数。建议浓缩胶电泳参数为恒压80V,分离胶采用恒压120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时,停止电泳,关闭电泳仪电源。
3、转膜

(1)准备工作

  • a. 转膜缓冲液可提前2h (即开始电泳后)放入-20℃冰箱预冷。
  • b. 根据胶的面积大小,将滤纸以及NC膜剪裁至合适尺寸。
  • c. 建议目的蛋白大于20KD可选择0.45μm NC膜;目的蛋白小于20KD可选择0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜。选择完毕后将膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用。注意使用PVDF膜需先放入甲醇中浸泡1min左右至均匀浸透,没有白点即可放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

(2)转膜

  • 根据目的蛋白大小,选择合适的转膜条件(见附表)。
4、封闭
  • 转膜完成后,将膜取出,放入合适的抗体孵育槽中,加入Western Blocking Buffer 室温孵育1h,加入TBST Buffer洗涤3次,每次5 min。
5、抗体孵育

根据所使用的一抗种类,选择进行下述其中1项的具体步骤

(1)对于无偶联的一抗

  • a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗体说明书推荐比例进行稀释,室温孵育1.5h或4℃过夜孵育。
  • b. TBST Buffer洗涤4次,每次5 min。
  • c. 按一抗来源选取合适的HRP偶联二抗,按照合适比例进行稀释,室温孵育1h。
  • d. TBST Buffer洗涤4次,每次5 min。
  • e. 继续进行后续曝光操作。

(2)对于偶联有HRP的一抗

  • a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗体说明书推荐比例进行稀释,室温孵育1.5h或4℃过夜孵育。
  • b. 用TBST Buffer洗涤4次,每次5 min。
  • c. 继续进行后续曝光操作。
6、曝光
  • a. 吸取等体积ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ混匀,配制成发光检测工作液。推荐用量为每10cm2的膜使用1-2 mL发光检测工作液即可。
  • b. 用镊子将膜取出,膜的下缘轻轻接触吸水纸,去除膜上多余的液体。用移液枪吸取工作液并均匀覆盖转印膜,室温孵育 1-2 minutes,此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
  • c. 获取WB结果:
    1) 传统压片曝光显影:将膜固定于片夹内。暗室内压片1分钟,立即显影定影,根据结果再调整压片时间获取最佳信噪比图片。或直接分别压片 30 秒、1、3、5分钟,然后一起显影定影观察结果。
    2) 化学发光成像仪获取电子图片:将膜放置到成像仪内,参考仪器说明书设置合适的参数以获取优化图片。同时应根据靶蛋白的生物学性质如丰度等来调节成像参数。

附表1:BSA标准品稀释

1mg/ml BSA(μl) 稀释液(μl) 对应的蛋白含量(mg/ml)
0 20 0
1 19 0.05
2 18 0.1
4 16 0.2
8 12 0.4
12 8 0.6
16 4 0.8
20 0 1

附表2:分离胶浓度的选择

分子量(kDa) 分离胶浓度
X≤10 15%
10<X≤15 13.5%
15<X≤25 12%
25<X≤35 11%
35<X≤40 10%
40<X≤55 9%
55<X≤70 8%
70<X≤100 7%
100<X 6%
备注:X为目的蛋白大小

附表3:分离胶配制

分离胶浓度 6% 7% 8% 9% 10% 11% 12% 13.5% 15%
去离子水(mL) 5.3 4.9 4.6 4.3 4.0 3.65 3.3 2.8 2.3
30%丙烯酰胺 (mL) 2 2.4 2.7 3.0 3.3 3.65 4.0 4.5 5.0
1.5M Tris-HCL(pH8.8) (mL) 2.5
10%SDS(mL) 0.1
10%AP(mL) 0.1
TEMED(mL) 0.01
总体积(mL) 10

附表4:5%浓缩胶配方

5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶
去离子水(mL) 1.1 2.1 2.7 3.4 4.1
30%丙烯酰胺 (mL) 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0
1.0M Tris-HCL(pH6.8) (mL) 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75
10%SDS(mL) 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
10%AP(mL) 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
TEMED(mL) 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006
总体积(mL) 2 3 4 5 6

附表5:转膜条件选择

分子量(kDa) 建议转膜条件(湿转)
X≤10 恒流200mA,30min
10<X≤15 恒流200mA,40min
15<X≤20 恒流200mA,50min
20<X≤50 恒流200mA, 1kDa/min+20min
50<X≤100 恒流200mA, 1kDa/min+30min
100<X≤150 恒流250mA, 1kDa/min+20min
150<X≤180 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在3h内)
180<X 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在4h内)
备注:X为目的蛋白大小以上为建议转膜条件,可根据使用转移设备的转膜效率、目的分子量大小等综合选择合适的转膜条件。针对大分子量或极小分子量蛋白,尤其注意需合理调整转膜液、转膜条件、转膜温度等问题。
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IHC-P

IHC-P免疫组织化学标准操作流程(石蜡切片——非磷酸化项目检测)

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

电磁炉、压力锅、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、光学显微镜、移液器、孵育湿盒、抗原修复盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液:0.01M PBS pH7.2±0.2; 0.01M pH7.2 PBST;
  • (2) 修复液(可选):
    pH6.0 0.01M柠檬酸修复液(1L):C6H8O7•H2O 0.4g;NaC6H5O7•2H2O 3g;pH6.0;
    pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液(1L):C4H11NO3 1.21g;C10H14N2Na2O8•2H2O 0.37g;pH9.0。
  • (3) 3%过氧化氢(需新鲜配制,30% H2O2与dH2O体积比1:9);
  • (4) 抗体稀释液:1X PBS + 5% 正常血清 + 0.3% Triton™ X-100;
  • (5) EnVision Systems检测体系, HRP显色系统: HRP RABBIT/MOUSE及配套DAB显色液;
  • (6) 脱蜡液、无水乙醇(分析纯)、去离子水(dH2O)、苏木素、中性树胶封片剂。

二、实验步骤

1.脱蜡、水化:
  • (1)烤片:将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上,将其放入65℃的恒温箱中烤片30分钟;同时将脱蜡液1缸一起放入65℃的恒温箱中;
  • (2)脱蜡至水:将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温,5分钟后,将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中,并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、95%乙醇、80%乙醇的顺序依次将石蜡切片放入缸中,每缸5分钟;用流水清洗切片5分钟
注意:流水清洗时水流不能直接对着切片;操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
2.内源性过氧化物酶灭活:
  • 将切片完全浸入到3%双氧水溶液中,室温,孵育10分钟;完成后流水清洗5分钟。
注意:内源性酶含量高的组织,可以延长灭活时间至15-20分钟;双氧水需新鲜配制,可提前5-10分钟配制3%的双氧水。
3.抗原修复(可选):
  • (1)方法一,低pH值高压热修复:在高压锅中,加入pH6.0柠檬酸抗原修复液,高火预热;待修复液沸腾后将切片置于其中,并完全浸泡组织,盖好锅盖,扣上压力阀,高火继续加热;待限压阀开始转动喷气后调至中火,同时开始计时3分钟;计时结束后离开热源,自来水冲洗(约15s),安全阀降落后开盖,待修复液温度降至室温后,用缓冲液PBST洗涤3次,每次1min。
  • (2)方法二,高pH值高压热修复:在高压锅中,加入pH9.0 EDTA抗原修复液,高火预热;待修复液沸腾后将切片置于其中,并完全浸泡组织,盖好锅盖,扣上压力阀,高火继续加热;待限压阀开始转动喷气后调至中火,同时开始计时2分钟;计时结束后离开热源,自来水冲洗(约15s),安全阀降落后开盖,待修复液温度降至室温后,用缓冲液PBS洗涤3次,每次1min。
注意:修复液需完全浸没切片上组织;修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序;修复液可根据实验需求自行选用修复液;修复时间可根据组织前处理状态适当调整。
4.染色:
  • (1)擦干组织周围水分,用免疫组化疏水笔在组织周围划圈,PBST洗涤2次,每次1min。
  • (2)一抗孵育:甩干组织周围水分,在组织切片上滴加已稀释的一抗,水平放置于孵育湿盒中,于室温(25℃)孵育1.5小时;
  • (3)洗涤:去除抗体工作液,用缓冲液PBST洗涤3次,每次5分钟;
  • (4)二抗孵育:甩干组织周围水分,在组织切片上滴加二抗工作液,水平放置于孵育湿盒中,于室温(25℃)孵育30分钟;
  • (5)洗涤:去除切片上的二抗工作液,用缓冲液PBST洗涤3次,每次5分钟;
  • (6)显色:显色前5分钟,配置DAB显色工作液,C液:B液体积比1:50,充分混匀;在组织切片上滴加显色工作液,室温(25℃)孵育8分钟;
  • (7)洗涤:将切片浸入大量dH2O中即可终止显色,流水冲洗2分钟;
  • (8)复染:将切片浸入苏木素中浸泡20秒,再用流水清洗2分钟;
  • (9)返蓝:将切片浸入氨水中浸泡2min,返蓝2min,再用流水清洗2分钟。
注意:染色过程中需一直保持切片处于湿润状态;染色过程中所有试剂使用过程中均需保证完全覆盖切片上组织;不同二抗及检测系统敏感性不同,因此对应一抗最佳稀释比可能会有差异;不同厂家苏木素复染程序略有不同。
5.脱水、透明、封片:
  • (1)脱水:将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡2次,每次1分钟;高温(55℃-60℃)下完全干燥;
  • (2)透明:将切片于二甲苯中浸入1次,每次1min;
  • (3)封片:在切片中心滴加适量中性树胶,并加盖盖玻片。
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IF/ICC

免疫荧光实验操作流程(细胞样本)

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

4℃冰箱、恒温恒湿箱、通风橱、移液器、避光孵育湿盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液:0.01M pH7.2±0.2 TBS ;0.01M pH7.2±0.2 TBST
  • (2) 固定液:4%中性甲醛固定液(TBS缓冲液配制)
  • (3) 抗体稀释液:1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
  • (4) 通透剂:0.3% Triton X-100(TBS缓冲液配制)
  • (5) 二抗(可选):
    使用兔源一抗可选二抗:
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074;
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073;
    使用鼠源一抗可选二抗
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077;
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076;
  • (6) 染核试剂:1mg/mL DAPI(用时使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制)
  • (7) 去离子水(dH2O)、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1.样本前处理
  • (1) 弃去培养基,在细胞上缓慢加入常温TBS,清洗2次,每次5秒;
  • (2) 细胞固定:在细胞上覆盖 4%中性甲醛固定液(TBS缓冲液配制),置于4℃,固定15min;固定液需足量;
  • (3) 固定液的清洗:去除固定液,使用4℃预冷的TBS缓冲液,漂洗3次,每次5分钟;
  • (4) 通透:对于细胞骨架,细胞器或细胞核定位蛋白,可增加通透步骤,使用冰甲醇冰上处理5-10min(可选);
注意:需避免实验操作时温差过大或温度骤变;固定液需保证足量,可过量使用;甲醛有毒性,加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作。
2.染色步骤
  • (1)封闭:用5%空白山羊血清将样本完全覆盖,切片需放置于湿盒内,细胞孔板可直接将孔板密封好,置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min;
  • (2)一抗孵育:去除封闭液,直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液,样本需完全覆盖,切片需放置于湿盒内,细胞孔板可直接将孔板密封好,置于4℃孵育过夜;
  • (3)复温:将样本置于常温,复温15min,去除抗体工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (4)二抗孵育:在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液,样本需完全覆盖,避光,37℃,孵育1小时;去除二抗工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (5)染核:在样本上滴加DAPI工作液,使用0.01M pH7.2±0.2 TBS缓冲液配制,DAPI溶液:TBS缓冲液体积比1:1000,避光,室温,孵育30分钟;去除DAPI工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (6)细胞孔板可直接加入抗荧光衰减封片剂后,于荧光显微镜下观察并采集图像;细胞涂片滴加抗荧光衰减封片剂,然后加盖盖玻片封片,再于荧光显微镜下观察并采集图像;细胞爬片可取出,盖在滴加抗荧光衰减封片剂的载玻片上后,于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意:实验中,所有试剂滴加应准确、快速、足量,不能出现干片的情况;染色步骤从二抗孵育开始,后续所有步骤都需注意避光操作;染色完成后需及时观察并采集图像,避免干燥和荧光物质淬灭。

免疫荧光实验操作流程(石蜡切片)

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、移液器、避光孵育湿盒、抗原修复盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液:0.01M pH7.2±0.2 TBS ;0.01M pH7.2±0.2 TBST
  • (2) 修复液(可选):
    pH6.0 0.01M柠檬酸修复液(1L):C6H8O7•H2O 0.4g;NaC6H5O7•2H2O 3g;pH6.0;
    pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液(1L):C4H11NO3 1.21g;C10H14N2Na2O8•2H2O 0.37g;pH9.0。
  • (3) 封闭液:5%空白山羊血清
  • (4) 抗体稀释液:1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
  • (5) 二抗:
    使用兔源一抗可选二抗:
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074;
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073;
    使用鼠源一抗可选二抗:
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077;
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076;
  • (6) 染核试剂:1mg/mL DAPI(用时使用0.01M pH7.2±0.2 TBS配制)
  • (7) 去离子水(dH2O)、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1.水化/脱蜡:
  • (1) 烤片:将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上,将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟;同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中;
  • (2) 脱蜡至水:将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温,5分钟后,将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中,并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、95%乙醇的顺序依次将石蜡切片放入缸中,每缸5分钟;用流水清洗切片5分钟。
注意:流水清洗时水流不能直接对着切片;操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
2.抗原修复:
  • (1)方法一,微波热修复:将切片浸入盛有修复液的修复盒中,将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上;整体放入微波炉中,高火加热3分钟后停火,微波炉内静置5分钟;再高火加热3分钟后停火,微波炉内静置5分钟;随后中低火加热1分钟后停火,微波炉内静置5分钟,然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。
    注意:修复液需完全浸没切片上组织;修复过程中严禁打开微波炉门;修复完成后不可快速冷却;修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
  • (2)方法二,高压热修复:在高压锅中,加入抗原修复液,高火预热;待修复液沸腾后将切片置于其中,并完全浸泡组织,盖好锅盖,扣上压力阀,高火继续加热;待限压阀开始转动喷气后调至中火,同时开始计时3分钟;计时结束后离开热源,自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后,用缓冲液洗涤3次,每次1min。
    注意:修复液需完全浸没切片上组织;修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序;修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
3.染色:
  • (1)封闭:用5%空白山羊血清将样本完全覆盖,切片需放置于湿盒内,置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min;
  • (2)一抗孵育:去除封闭液,直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液,样本需完全覆盖,切片需放置于湿盒内,置于4℃孵育过夜;
  • (3)复温:将样本置于常温,复温15min,去除抗体工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (4)二抗孵育:在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液,样本需完全覆盖,避光,37℃,孵育1小时;去除二抗工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (5)染核:在样本上滴加DAPI工作液,使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制,DAPI溶液:0.01M pH7.2 TBS缓冲液体积比1:1000,避光,室温,孵育30分钟;去除DAPI工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (6)滴加抗荧光衰减封片剂,然后加盖盖玻片封片,再于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意:实验中,所有试剂滴加应准确、快速、足量,不能出现干片的情况;染色步骤从二抗孵育开始,后续所有步骤都需注意避光操作;染色完成后需及时观察并采集图像,避免干燥和荧光物质淬灭。
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