纯化柱分离荧光脂质体和杂蛋白的效果
通过外泌体颗粒与蛋白含量的比值可从整体上分析外泌体的纯度。从头对头对比数据中可知：外泌体纯化分离得到的外泌体 particle 数与蛋白含量比值最高，表明 外泌体纯化分离的外泌体纯度更高，杂蛋白含量更低。
通过比较不同外泌体纯化方法下的 miRNA qPCR 定量结果可见（上图右）：由于 外泌体纯化富集的外泌体得率更高、纯度更高，使得外泌体的 miRNA定量值更高，而游离 miRNA 定量值非常低，能够更准确分析外泌体来源 miRNA。
蛋白酶+RNA 酶消化试验也进一步证实了 外泌体纯化得到的 RNA 更多的是来源于囊泡，而非囊泡外的游离 RNA。
同一样本，不同人操作或不同起始体积在外泌体分离、RNA 提取和 qPCR定量过程均会有一定偏差，基于 外泌体纯化的荧光外泌体外参（ER）进行 Normaliza后的 RNA 定量结果一致性好。
外泌体（Exosomes）是由活细胞分泌的直径约 30-150nm 的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）。包含细胞来源的核酸、蛋白质和脂质等活性分子，具有介导细胞间通讯等功能，在哺乳动物繁殖和发育、免疫应答和感染、以及诸如代谢性疾病、心血管健康、神经退行性疾病和癌症在内的各种疾病中发挥重要作用，也是理想的液体活检标志物和治疗载体。
本试剂盒是专门用于从细胞上清、尿液等非复杂样本中提取细胞外囊泡的小量纯化试剂盒。试剂盒采用分子排阻色谱的原理，根据被分离组分的分子大小实现外泌体的分离。本试剂盒具有快速、高效、操作简单、对设备要求低等特点，可在60min内完成外泌体的分离纯化。提取的外泌体产物质量稳定可靠、蛋白污染程度低，可用于蛋白提取分析、RNA 提取分析、细胞功能检测等生物学实验。
外泌体纯化试剂盒仅用于科学研究，不用于临床诊断。尤其适用于各生物流体来源外泌体的 RNA、蛋白质和细胞功能学研究。
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Q1：为什么柱子取出后直接加 1mL PBS 测流速有点慢？
测流速之前，需先将柱子和 PBS 放置室温平衡，再加 2 倍柱体积 PBS冲洗柱子，待洗完柱子后再加 1mL PBS 测流速。
Q2：是否可反复使用，如果是不同的样本，会不会有交叉污染？
可以重复使用 5 次。通过 2 倍柱体积 PBS 进行柱再生。但变性的蛋白质或脂质复合物很难在柱再生步骤中被洗脱下来，积累过多会对分离的纯度和精度产生较大影响，因此可通过 0.5M NaOH 清洗柱子，然后再用 PBS 冲洗柱子，直至流出液 PH 呈中性。
Q3：细胞上清样本上样时，柱子可明显看到颜色，但已经收集了 10 个馏分后，柱子底部三分之一处仍有肉眼可见的颜色，是否正常？
囊泡是 nm 级别的微观存在，肉眼不可见，并非就存在于肉眼看到的红色部分。若实在不放心，可采用我们的外泌体质控品对外泌体的分布进行标定。
Q4：该试剂盒有没有文献支持？是否被认可？写出来的文章会不会被拒？
外泌体纯化试剂盒是 SEC 的原理，该原理的分离方法相关文献已经有很多了（例如 JEV 等高水平权威杂志上很多文章，都用到了 SEC 分离外泌体，包括细胞上清，血浆，脑脊液，尿液等样本形式，涵盖了方法学比较和应用等方面）；另外，这也是 ISEV（国际囊泡协会）推荐的方法，可以获得高特异的外泌体。
Q5：外泌体纯化是否适用于细胞共培养的功能实验？
外泌体纯化特别适合于细胞共培养等功能性研究，因为，首先，分离过程中不会引入物理剪切力损伤（超速离心）以及化学物质污染（PEG），最大限度的保证了外泌体完整的生物结构与生物学活性。其次，外泌体纯化的高回收率保证了可用于细胞共培养的外泌体量。第三，外泌体纯化去掉了更多杂蛋白得到更高纯度外泌体（上面的数据性能展示中），在细胞实验中可以最大限度的避免了未知成分带来的生物活性影响。
Q6：可以使用尿液这种大体积样本吗？
尿液样本属于大体积的样本，在上样前需用超滤管进行浓缩，可浓缩约30 倍，也即 30mL 尿液可以浓缩至 1mL。可自行购买 100kD 超滤管，亦从我们这里购买（密理博超滤管）。
Q7：SEC 法不适合大量细胞分离外泌体，有什么解决办法？相较于超离法，排阻柱填料是否会有残留物影响外泌体纯度不利于治疗方面的研究和应用？
首先，基于 SEC 的分离和纯化技术，在蛋白和单抗制剂的生产中已经属于成熟工艺。例如，在 2015 年 ISEV 的一篇 position paper（Applying extracellular vesicles based therapeutics in clinical trials – an ISEV position paper，DOI：10.3402/jev.v4.30087）中专门提到，未来用于治疗的外泌体分离方法，建议参考蛋白类制剂的生产工艺，例如 SEC、IEC、切向流过滤以及这几种方法相互配合的工艺路线。因此，SEC 填料的残留问题至少在 ISEV 看来不构成威胁。
其次，SEC 处理大规模细胞上清的难度，回答这个问题的关键是看跟什么技术进行比较。国际社会上对这一方法进行比较时，通常是跟密度梯度离心直接对标，因为 PEG 沉淀和差速离心得到的产物纯度无法跟前面两个相提并论。如下图（toward exosome-Based therapeutics: isolation, Heterogeneity, and Fit-for-purpose potency，DOI： 10.3389/fcvm.2017.00063）黄色高亮处标记的，密度梯度离心虽然产物纯度高，但存在这么几个问题，包括 i）蔗糖垫可能导致渗透压过高；ii）相比 SEC 对大体积样本的兼容性更差等。所以上样前的超滤浓缩从一定程度可解决该问题，另外国际上有将近 1L 体积的排阻柱子用于细胞上清的处理。
