Oligo d(T)23VN (50 μM) (RK20115)

逆转录酶的适宜反应温度都是42°C，在42-48°C均有活性。但是对于某些GC含量高的基因或二级结构复杂的基因，在42°C不足以打开二级结构，使cDNA合成无法顺利进行，此时需要在高温65°C条件下使RNA模板/引物变性5 min以获得较好的结果。

ABclonal逆转录产品推荐的反应体系均是20 μL。

其他竞品的逆应体系基本也是20 μL。

客户可以按等比放大或缩小反应体系，但反应体系控制在10-50 μL，否则会影响逆转录效果。

现在市面上的RNA提取试剂盒中都含有基因组DNA去除步骤，所以逆转录产品一般可以不去基因组。如果考虑基因组DNA的污染，可以在qPCR的引物设计时跨内含子。如果引物设计未跨内含子，同时提取的RNA中有基因组DNA残留，此时需要在逆转录产品中需要增加去基因组DNA模块。

去基因组后效果不一定更好，如果DNase I降解DNA产生大量的寡核苷酸片段，可以作为qPCR反应的模板，会产生一些非特异性扩增。

RNase H高活性能够催化降解RNA/DNA杂交体中的RNA。RNase H低活性减少了第一链cDNA合成反应中RNA/DNA杂交体中模板RNA被降解，从而保证第一链cDNA的合成量和长度。

在逆转录反应前一定要电泳验证RNA的完整性，确认RNA没有降解。RNA模板不要保存时间太长，尽快进行逆转录及PCR操作。

通过变性琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性；RNA的A260/A280比值大于1.7；乙醇沉淀，然后70％乙醇洗涤可以除去大多数污染物，例如EDTA和胍类；用氯化锂沉淀可以去除多糖；苯酚/氯仿提取和乙醇提取可以去除蛋白污染，如蛋白酶；一些靶RNA可能包含RT的强终止序列; 建议使用随机引物而不是d(T)23VN；使用足量的RNA。

从cDNA进行基因克隆时，突变有可能发生在逆转录过程，也可能发生在PCR过程中。一般用高保真DNA聚合酶（如：KFX DNA聚合酶）进行扩增，控制较低的循环数；也可通过减少模板量、减少循环数降低突变几率。

RNA被降解：分离无污染、高质量的RNA；提取RNA的材料要尽量新鲜，RNA的A260/A280比值大于1.7。防止RNA降解，逆转录反应前，通过变性琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。RNA提取后，应保存在100%甲酰胺中。如果使用RNase抑制剂，逆转录温度应低于45°C，反应体系中pH低于8.0，否则抑制剂会释放所结合的RNase，而且，RNase抑制剂必须在0.8 mM DTT存在时才有活性。

RNA中包含逆转录反应的抑制剂：逆转录抑制剂包括SDS、EDTA、甘油、焦磷酸鈉、亚精胺、甲酰胺和肌盐等，将对照RNA和样品混合，进行产量比较，以检验是否有抑制剂。然后70％乙醇洗涤可以除去大多数污染物，例如EDTA和胍类；用氯化锂沉淀可以去除多糖；苯酚/氯仿提取和乙醇提取可以去除蛋白污染，如蛋白酶。

用于合成cDNA第一链合成的引物的退火不充分：确定逆转录温度适合实验所用的引物。对于随机引物，建议在反应温度前先在25°C处理10 min，对于基因特异性引物，可以试一下其他特异性引物或换用Oligo(dT)或随机引物。

起始RNA量较少：使用足量的RNA 模板。

一些靶RNA可能包含逆转录的强终止序列：建议使用随机引物而不是d(T)₂₃VN。

目的序列在分析的组织中不表达：尝试其他组织。

PCR反应失败：对两步法q-PCR，cDNA模板不能超过反应体积的1/5。

引物和模板的非特异性退火：避免引物3΄端含有2到3个dG或dC。在第一链合成中使用基因特异性引物，而不是随机引物或Oligo(dT)。以逆转录的cDNA在qPCR中为模板，开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的遇火温度。使用热启动Taq DNA酶进行PCR，提高反应的特异性。

基因特异性引物设计较差：基因特异性引物设计与普通扩增引物设计采用相同的原则。

RNA中有基因组DNA的污染：使用扩增级(无宿主基因组残留)DNase I处理RNA，设置无逆转录酶对照实验检测基因组DNA污染。

形成引物二聚体：设计在3端没有互补序列的引物。

Mg²⁺浓度太高：对于每种模板和引物的组合，优化不同的镁离子浓度。

外源DNA气溶胶污染：使用带滤芯的枪头和UDG酶。

cDNA产物的含量过高：PCR反应体系中减少cDNA的加入量。

PCR反应中引物过多：减少引物的用量。

循环数过多：优化PCR反应条件，减少PCR的循环次数。

退火温度过低：提高退火温度，防止非特异性的起始及延伸。

DNase I降解DNA使产生的寡核苷酸片段作为模板产生的非特异性扩增：提取高质量RNA，防止被DNA污染（尽量提取无基因组残留的RNA）。

qPCR是将RNA先逆转录为cDNA，然后以cDNA作为模板进行靶标片段扩增。

用于逆转录的引物根据实验的具体情况选择随机引物，Oligo(dT)及基因特异引物的一种。对于短的不具有发卡结构的真核續胞mRNA三种引物都可。

随机引物：适用于长的具有发卡结构的RNA或一些含逆转录的强终止序列的靶RNA，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的逆转录。主要用于单一模板的逆转录反应。

Oligo(dT)引物：适用于具有polyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA，真核生物的rRNA和tRNA不具有polyA尾巴。）由于Oligo(dT)要结合到polyA尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

基因特异引物：能与模板序列互补，适用于目的序列已知的逆转录。

内参法：理论上，逆转录的cDNA是长度不同的DNA片段，所以电泳条带应该均匀分布在泳道上，如果RNA丰度低，电泳检测也可能无产物，这种情况通过PCR扩增内参基因，如果有扩增产物，cDNA的质量基本上可以保证(少数情况下：如目的基因片段过长，可能会有例外)。

已知基因扩增法：如果有已知以此模板扩出来的基因，可以用此基因的引物验证。能扩增出内参，不一定就说明cDNA没有问题。因为内参在cDNA中丰度高，很容易扩出。如果cDNA因为各种原因导致部分降解，从几率的角度讲，就会大大影响低丰度的目的基因的PCR结果，而内参因为依然是高丰度，扩增很可能不受影响。

RNA部分降解，检测提取RNA的完整性及纯度

不同物种的RNA情况可能不一样，但一般提取成功的总RNA在凝胶电泳中应包含两条清晰的28S和18S rRNA条带，并且前者条带的亮度应是后者的2倍，出现5S带代表RNA发生了降解，其亮度与降解程度成正比。内参基因扩增效果好并不能说明RNA质量优异，因为内参的表达量大，只要是RNA降解的不严重都可以有较好的扩增。分光光度计测的纯RNA的A260/A280的比值应控制在1.9-2.1，提取的RNA有少量蛋白污染会使比值降低，但只要A260/A280的比值大于1.7就不会影响逆转录，最重要的是RNA的完整性。

RNA是否降解严重以及逆转录是否成功：一般情况下，内参基因无扩增很大部分原因是RNA模板严重降解，另一个可能是逆转录失败。虽然内参不能作为判断cDNA质量的标准，但在使用高质量RNA模板的情况下却可以作为逆转录是否成功的标准。

扩增内参基因的引物是否可靠以及PCR所用的试剂有无问题。

一步法RT-PCR即逆转录与PCR扩增在同一个体系内完成。这有助于减少污染几率。由于得到的所有cDNA样品都用来扩增，所以灵敬度更高，最低可以使用0.01 pg的总RNA。成功的一步法RT-PCR,一般使用基因特异性引物起始cDNA合成。

两步法RT-PCR即逆转录和PCR扩增分两步进行，首先进行RNA逆转录得到cDNA，然后以cDNA为模板进行qPCR反应，两步法可以使用Oligo(dT)或随机引物进行cDNA合成，可以从一个特定的样品中逆转出所有mRNA的信息。

总的来说，一步法更方便，可适用于大量样品分析或定量PCR。两步法在选择聚合酶和引物时具有更大的灵活性，但需要注意的是，一步法中由于逆转录与PCR反应在同一反应体系中进行，使用同一反应Buffer两者反应条件不能进行同时优化，且逆转录步骤在一些PCR反应Buffer中效率很低，因此一般不推荐使用。