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ABScript II 一步法 RT-qPCR 探针试剂盒

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货号: RK20407

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产品描述

ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit是采用探针法进行RT-qPCR反应的专用试剂盒。本试剂盒以RNA为模板,使用基因特异引物,逆转录和PCR反应可在同一管内连续进行,不用额外的开管、移液等操作,大大提高了检测通量,并能有效防止污染。本反应体系可以对扩增产物进行实时检测,大大提高了检测灵敏度,并且省略了PCR反应后的电泳步骤,非常适合于RNA等微量RNA的检测。本制品使用适合RT-qPCR 的逆转录酶ABScript II Reverse Transcriptase高效合成第一链cDNA,搭配使用探针和Taq DNA Polymerase,配合经过优化的缓冲体系,具有高扩增效率和高扩增灵敏性,能稳定高效的进行一步法 RT-qPCR反应。

产品组分

2X One Step RT-qPCR Probe BufferRM21462
One Step Probe HS TaqRM21463
ABScript II RT Enzyme MixRM21464
50X ROX Dye IRM21465
50X ROX Dye IIRM21466
RNase-free ddH2ORM20214

产品信息

应用PCR, RT-qPCR, RT-PCR and cDNA Synthesis, DNA Amplification, PCR & qPCR
保存温度-20°C

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qPCR实验常见问题与解决方案

1、熔解曲线出现多峰

引物设计不够优化:根据引物设计原则重新设计引物。

引物浓度太高:适当降低引物浓度。

2、扩增曲线形状异常

扩增曲线不光滑:信号太弱,提高模板浓度并重复实验。

个别扩增曲线骤降:反应管内有气泡,由于温度升高后气泡破裂,使仪器检测到的荧光值突然降低所致。处理样本时要注意离心,加样过程中尽量避免吸打出气泡。

扩增曲线上飘:仪器测试默认基线设置为3至15个循环荧光值的标准差,可根据实际扩增情况进行相应基线调整。

3、反应结束无扩增曲线出现

反应循环数不够:一般设置循环数为40,但需注意的是过多的循环会增加过多的背景信号,降低数据可信度。

确认引物是否降解:长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除引物降解的可能性。

确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

模板浓度太低:减少稀释程度并重复实验。

模板降解:重新制备模板,重复实验。

预变性时间不足:本产品采用热启动的Taq酶,请确保按照反应程序设置的3 min预变性时间进行实际操作。

4、Ct值出现太晚

扩增效率极低:优化反应条件,重新设计引物。

模板浓度太低:减少稀释程度,重复实验。

模板降解:重新制备模板,重复实验。

PCR产物太长:一般将PCR产物长度设计为70~200 bp范围内。

反应体系中存在PCR反应抑制剂:一般为加入模板时带入,加大模板稀释倍数或者重新制备新的模板。

预变性时间不足:本产品采用热启动的Taq酶,请确保按照反应程序设置的3 min预变性时间进行实际操作。

5、阴性对照(NTC)出现明显扩增

反应体系或者水被污染:更换新的Buffer或者水进行重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。

引物二聚体的出现:一般在35个循环以后阴性对照出现扩增属正常情况,可配合熔解曲线进行分析。

6、重复性差

加样体积不准:使用性能较好的移液枪,扩大反应体系,增加组分加入体积。

定量PCR仪孔间温度不一致:定期校准仪器。

模板浓度太低:模板浓度越低,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。

阈值设置:对于不同板间的重复试验,请确保两次试验仪器阈值设置保持一致。

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