引物设计不够优化：根据引物设计原则重新设计引物。

引物浓度太高：适当降低引物浓度。

扩增曲线不光滑：信号太弱，提高模板浓度并重复实验。

个别扩增曲线骤降：反应管内有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。处理样本时要注意离心，加样过程中尽量避免吸打出气泡。

扩增曲线上飘：仪器测试默认基线设置为3至15个循环荧光值的标准差，可根据实际扩增情况进行相应基线调整。

反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。

确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除引物降解的可能性。

确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

模板浓度太低：减少稀释程度并重复实验。

模板降解：重新制备模板，重复实验。

预变性时间不足：本产品采用热启动的Taq酶，请确保按照反应程序设置的3 min预变性时间进行实际操作。

扩增效率极低：优化反应条件，重新设计引物。

模板浓度太低：减少稀释程度，重复实验。

模板降解：重新制备模板，重复实验。

PCR产物太长：一般将PCR产物长度设计为70~200 bp范围内。

反应体系中存在PCR反应抑制剂：一般为加入模板时带入，加大模板稀释倍数或者重新制备新的模板。

预变性时间不足：本产品采用热启动的Taq酶，请确保按照反应程序设置的3 min预变性时间进行实际操作。

反应体系或者水被污染：更换新的Buffer或者水进行重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。

引物二聚体的出现：一般在35个循环以后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。

加样体积不准：使用性能较好的移液枪，扩大反应体系，增加组分加入体积。

定量PCR仪孔间温度不一致：定期校准仪器。

模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。

阈值设置：对于不同板间的重复试验，请确保两次试验仪器阈值设置保持一致。