ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit是采用探针法进行RT-qPCR反应的专用试剂盒。本试剂盒以RNA为模板，使用基因特异引物，逆转录和PCR反应可在同一管内连续进行，不用额外的开管、移液等操作，大大提高了检测通量，并能有效防止污染。本反应体系可以对扩增产物进行实时检测，大大提高了检测灵敏度，并且省略了PCR反应后的电泳步骤，非常适合于RNA等微量RNA的检测。本制品使用适合RT-qPCR 的逆转录酶ABScript II Reverse Transcriptase高效合成第一链cDNA，搭配使用探针和Taq DNA Polymerase，配合经过优化的缓冲体系，具有高扩增效率和高扩增灵敏性，能稳定高效的进行一步法 RT-qPCR反应。
| 应用 | PCR, RT-qPCR, RT-PCR and cDNA Synthesis, DNA Amplification, PCR & qPCR |
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| 产品组分 |
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| 保存温度 | -20°C |
| Unit Assay Conditions | RM21466,50X ROX Dye II|RM21465,50X ROX Dye I|RM21464,ABScript II RT Enzyme Mix|RM21463,One Step Probe HS Taq|RM21462,2X One Step RT-qPCR Probe Buffer|RM20214,Nuclease-free H2O| |
Q1：熔解曲线出现多峰
引物设计不够优化：根据引物设计原则重新设计引物。
引物浓度太高：适当降低引物浓度。
Q2：扩增曲线形状异常
扩增曲线不光滑：信号太弱，提高模板浓度并重复实验。
个别扩增曲线骤降：反应管内有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。处理样本时要注意离心，加样过程中尽量避免吸打出气泡。
扩增曲线上飘：仪器测试默认基线设置为3至15个循环荧光值的标准差，可根据实际扩增情况进行相应基线调整。
Q3：反应结束无扩增曲线出现
反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。
确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除引物降解的可能性。
确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
模板浓度太低：减少稀释程度并重复实验。
模板降解：重新制备模板，重复实验。
预变性时间不足：本产品采用热启动的Taq酶，请确保按照反应程序设置的3 min预变性时间进行实际操作。
Q4：Ct值出现太晚
扩增效率极低：优化反应条件，重新设计引物。
模板浓度太低：减少稀释程度，重复实验。
模板降解：重新制备模板，重复实验。
PCR产物太长：一般将PCR产物长度设计为70~200 bp范围内。
反应体系中存在PCR反应抑制剂：一般为加入模板时带入，加大模板稀释倍数或者重新制备新的模板。
预变性时间不足：本产品采用热启动的Taq酶，请确保按照反应程序设置的3 min预变性时间进行实际操作。
Q5：阴性对照(NTC)出现明显扩增
反应体系或者水被污染：更换新的Buffer或者水进行重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
引物二聚体的出现：一般在35个循环以后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
Q6：重复性差
加样体积不准：使用性能较好的移液枪，扩大反应体系，增加组分加入体积。
定量PCR仪孔间温度不一致：定期校准仪器。
模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。
阈值设置：对于不同板间的重复试验，请确保两次试验仪器阈值设置保持一致。
