| 组分 | 50 RXN (20 μL/RXN) | 250 RXN (20 μL/RXN) |
| Entrans 2X qPCR Probe Master Mix V2 | 500 μL | 1.25mL X 2 |
| 50X ROX Dye I | 20μL | 100μL |
| 50X ROX Dye II | 20μL | 100μL |
Q1：扩增曲线形状异常
a.扩增曲线不光滑：信号太弱，提高模板浓度并重复实验。
b.个别扩增曲线骤降：反应管内有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光信号突然降低所致。处理样本时要注意离心、加样过程中尽量避免出现气泡。
扩增曲线上飘：仪器默认基线为3-15个循环的荧光值，可根据实际扩增情况调整基线。另外模板或引物降解也可导致曲线上飘 (必要时请进行电泳确认)。
Q2：反应结束无扩增曲线
a.反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需注意的是过多的循环会增加背景信号，降低数据可信度。
b.确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除引物降解的可能性。
c.确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
d.模板浓度太低：减少稀释倍数并重复实验。
e.模板降解：重新制备模板，重复实验。
预变性时间不足：本产品采用化学修饰热启动的Taq DNA聚合酶，建议延长预变性时间，可以将预变性时间延长为10 min。
Q3：Ct值出现太晚
a.扩增效率极低：优化反应条件，重新设计引物。
b.模板浓度太低：减少稀释倍数，重复实验。
c.模板降解：重新制备模板，重复实验。
d.PCR产物太长：一般设计扩增子长度为70 -200 bp。
反应体系中含有PCR抑制剂：一般由模板引入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板。
Q4：阴性对照也出现明显扩增
反应体系或者水被污染：更换新的Mix或水重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
Q5：重复性差
a.加样体积失准：使用校准的移液器，增大微量试剂体积。
b.定量PCR仪器孔间温度不一致：定期校准仪器。
c.模板浓度太低：减少模板稀释倍数或提高加样体积。
d.阈值设置：对于不同板间的重复实验，请确保两次阈值设置一致。
