ABclonal提供的免疫共沉淀(Co-IP)大致实验流程为:构建目标基因的质粒,共转细胞,在细胞裂解液中加入抗诱饵蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G,若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目标蛋白+诱饵蛋白+抗诱饵蛋白抗体+Protein A或G”,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。
根据现实中免疫共沉淀实验目的的不同,ABclonal技术人员可协助客户设计实验方案,构建原核或真核表达质粒,利用标签蛋白抗体检测,无需额外购买或定制抗体,另外我们采用进口的免疫共沉淀试剂盒进行实验,protein A磁珠吸附效率高,我们实验成功率90%以上。
常见问题 | 可能原因 | 解决方法 |
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未检测到目的蛋白或蛋白很少 | 样品被蛋白酶降解 | 添加蛋白酶抑制剂;所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融 |
抗体浓度太低 | 调整IP和/或IB抗体浓度,必要时设立浓度梯度,摸索最佳浓度 | |
抗抗体亲合力太低 | 选用适合于IP和/或IB的相应抗体 | |
IP抗体未与agarose珠子结合 | 选用适合于IP的相应珠子, 正确保存防止变质或干燥 | |
Tag未暴露在融合蛋白构象的表面 | 改变Tag融合表达部位 | |
裂解液严谨度太高 | 换用低严谨度裂解液 | |
目的蛋白高背景 | 非特异蛋白结合 | 在无血清培养液中裂解细胞; 在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子预洗免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度(高盐或去垢剂) |
裂解液严谨度太低 | 改用高严谨度裂解液 | |
实验仪器或液体被污染 | 使用洁净的仪器或液体 | |
转移膜上的非特异吸附 | 戴手套, 用镊子夹取, 不要接触膜转移面 |