蛋白表达系统介绍1 定义 蛋白表达系统指宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过这个体系可以实现外源基因顺利的实现在宿主中表达。蛋白表达体系通常由以下几部分组成：（1）宿主：用来表达的生物体，可以为细菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种宿主生物本身的特性多种多样，因此采用的表达体系也不相同。（2）载体：载体的选择需要根据宿主而定，根据宿主不同，分为原核（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中还有外源基因片段，外源基因通过载体介导，可以在宿主中表达。（3）辅助成分：有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分，比如：昆虫-杆状病毒表达系统中的杆状病毒。2 不同蛋白表达系统的介绍类型大肠杆菌酵母细胞杆状病毒-昆虫细胞哺乳动物细胞表达系统原核真核真核真核优势经济；快速；高产量；应用广泛经济；快速；高产量；部分翻译后修饰基因容量大；可溶蛋白；适合毒性蛋白；类似哺乳动物系统翻译后修饰可溶蛋白；耕地内毒素；更好的活性；更好的翻译后修饰；可瞬时转染与稳定转染表达劣势包涵体；无翻译后修饰；大分子量蛋白表达困难非人源糖基化；高甘露糖修饰周期长；成本高；缺少部分糖基化周期长；成本高推荐表达细菌类蛋白；抗原类蛋白；细胞因子；酶类细胞因子；小分子量蛋白；酶类细胞质蛋白；毒性蛋白；跨膜蛋白；分泌蛋白；激酶分泌蛋白；跨膜蛋白胞外区；重组抗体；抗体片段3 蛋白产品应用 表达的重组蛋白常用于:（1）作为抗原制备抗体；（2）参与细胞实验与动物实验；（3）测定蛋白酶活；（4）研究蛋白相互作用；（5）研究蛋白结晶结构；（6）免疫组化实验；（7）药物蛋白研究、生产等。4 影响蛋白表达的因素（1）蛋白本身的特性：蛋白分子量大小、蛋白来源/物种、是否为毒性蛋白、蛋白翻译后修饰程度、蛋白自身结构的复杂程度；（2）宿主的选择：宿主本身的特性；（3）蛋白需求量：蛋白应用范围对应的需求量不同，所以要根据需求量确定表达系统；（4）质粒载体的选择：载体是携带外源基因的工具，要根据系统选择合适的载体才能使蛋白更好的表达；（5）融合标签的选择：蛋白重组表达过程中采用亲和标签融合达标由两方面作用，一方面是为了使蛋白纯化过程变得更加容易；另一方面是为了促进某些不溶性蛋白溶解；（6）蛋白表达系统的优化：重组蛋白实际表达过程中有可能会产生各种问题，因此表达系统的优化很重要。

ELISA试剂盒唾液样本的制备只要检测的生物体液样本中含有待测蛋白，且蛋白含量在试剂盒的检测范围内，理论上我们的试剂盒都是可以进行检测的，而且这些样本也在我们的售后范围内。唾液样本的制备：用唾液样本采集管收集样本，然后于2-8℃ 1,000×g离心15分钟，取上清即可检测，或分装后于-20℃或-80℃保存。避免反复冻融。注意：唾液一般饭后半小时内不易采集，因为刚进食的唾液中富含唾液淀粉酶，最好空腹时段采集。客户需要自己查文献或资料确认唾液中待测蛋白的含量，最好先进行预实验确定样本的最佳稀释比。

ELISA 组织样本处理方法ELISA（酶联免疫吸附剂测定）是一种快速、灵敏、准确可靠的一种定量分析方法，样本的处理对于 ELISA 实验的成功有着举足轻重的作用。 利用 ELISA 进行检测的样本类型包括常见的血液（血清、血浆），组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清以及不常见的皮肤组织、尿液、粪便、肺、泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水、前列腺液、精液、阴道分泌物等相关组织样本，这些样本收集的时间、处理方法和保存都会影响到 ELISA 实验的结果。下面就常见 ELISA 组织样本处理方法的整理。组织样本一般是制成组织匀浆，处理方法如下:1）取适量组织块，于预冷 PBS（0.02mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，称重后备用（组织块较大需先剪碎后再匀浆）。2）可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果：首先将组织块移入玻璃匀浆器，加入 5-10ml预冷 PBS(组织与 PBS 的质量体积比建议为 1:5，即 1g 样本加入 5ml PBS)进行充分研磨（有条件实验室可选用机器匀浆），该过程需在冰上进行；得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理（超声破碎过程中注意冰浴降温；反复冻融法可重复 2 次）。3）将制备好的匀浆液于 5000×g 离心 5 分钟，留取上清即可检测。4）如果样本需要长期保存，请添加蛋白酶抑制剂。根据实验需要，组织匀浆样本可先定量总蛋白，以便于统计分析数据。

缺氧因子HIF-α信号转导HIF1 调节诸多基因类型转录，这些基因可促进低氧环境的反应，包括调节血管生成、红细胞生成、细胞周期、代谢和凋亡的基因。HIF-α涉及多条信号通路，附件内容主要包含了Warburg 效应 和 Angiogenesis产品list。

染色质重塑差异标志物问题：表观修饰的表征，指示染色质重塑差异的标志物回复：染色质关闭标志 HP1 H3K9me3 H3K27me3 染色质开启标志 H3K4me3相关资料：1、什么是染色质重塑染色质重塑（Chromatin Remodeling）是一个重要的表观遗传学机制，基因表达的复制和重组等过程中，染色质的包装状态、核小体中组蛋白以及对应DNA分子会发生改变的分子机理。2、基因转录调控

影响转染效率的因素转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分为物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节。 公司产品HighGene转染试剂是一种新型高效的阳离子聚合物。它可以与核酸（包括质粒、siRNA、寡聚核苷酸）相互作用形成一种复合物将核酸转运到真核细胞内，适用于大部分真核细胞的细胞转染。关于阳离子转染试剂使用注意事项如下： 1、血清A、DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。B、一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。C、对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用专用转染试剂。有条件的话，可以用无血清培养基代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。2、抗生素(PS)抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，ICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。3、细胞状态 这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。细胞复苏后的3代左右时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化。大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。4、细胞铺板密度用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。因转染试剂对细胞有毒害作用，细胞太少，容易死。一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为1×106细胞/ml，确保转染时细胞没有长满或处于静止期。因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。细胞的融合度必须要达到90%才能做。5.启动子的选择获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。同其他启动子，如SV40和RSV(劳斯肉瘤病毒)相比，在BHK-21中其活性最高。这三种病毒启动子在T细胞来源的细胞系，如Jurkat中组成表达水平较低。转染后在培养基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat细胞中CMV启动子，而单PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白细胞)中的CMV启动子。SV40启动子的表达在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)时会提高，因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。6、DNA量高质量的DNA对于进行高效的转染至关重要。转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于300ng/ul。产物表达，48小时mRNA表达最高;72h蛋白表达最高。

我们转染试剂做siRNA转染时，推荐的是pmol单位，对于有客户提到的一般使用是nmol级别。这个是单位换算导致的理解错误，我们推荐的pmol是物质的量，客户说说的nmol是指浓度，单位是nM(nmol/lL)，本质是一样的，以6孔板为例，我们推荐转染siRNA是100pmol，6孔板中细胞培养基是2mL，那么siRNA的浓度就是50nmol/L，简称50nM。