ChIP实验可以灵敏地检测目的蛋白与特异 DNA结合情况,也可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。它能真实、完整地反映调控蛋白所结合在DNA 序列特征,是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域的金标准。ChIP-qPCR 完美结合了ChIP 技术和实时定量PCR技术。ChIP 技术利用抗体特异性富集与特定转录因子/ 组蛋白修饰结合的DNA 片段;qPCR 技术使用SYBR 荧光染料,特异性的掺入DNA 双链,发射荧光,保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步,最后利用Ct 值进行定量分析。ChIP-qPCR 能够专一,灵敏,快速,高重复地定量生物样品中特定转录因子/ 组蛋白修饰与已知DNA的结合。
双△CT法的一大特点是,当优化的体系已经建立后,在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线,而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。
ΔCt [normalized ChIP IP] = (Ct [ChIP IP] - (Ct [Input] -Log2 (Input Dilution Factor))),使用同样的公司计算出ChIP IgG的ΔCt。
Input Dilution Factor = 1/(fraction of the input chromatin saved)
比如:超声后样本共1ml,取10ul(1%)作为input组,则Input Dilution Factor=1/0.01=100。
% Input = 2 ^(-ΔCt [normalized ChIP IP or IgG])
先要加入阴性对照的Ct值:ΔΔCt [ChIP/NIS] = ΔCt [normalized ChIP] - ΔCt [阴性]。在计算Fold Enrichment = 2^ (-ΔΔCt [ChIP/NIS])。
Percent Input=X% X2 ^(CT Input Sample- CT IP or IgG Sample)
ChIP之前都会取一定比例的Input作为对照,称为% Input。如ChIP 每个IP是20 ug染色质,Input取了1 ug,则为5%的Input。
5% Input | H3K27me3 | IgG | |
---|---|---|---|
A(Target region) | 24 | 26 | 32 |
B(Negative region) | 26 | 33 | 32 |
C(Positive region) | 23 | 24 | 31 |
H3K27me3 | IgG | |
---|---|---|
A(Target region) | 5% x2(24-26)≈ 1.25% | 5% x2(24-32)≈ 0.01% |
B(Negative region) | 5% x2(26-33)≈ 0.04% | 5% x2(26-32)≈ 0.1% |
C(Positive region) | 5% x2(23-24)≈ 2.5% | 5% x2(23-31)≈ 0.02% |