服务介绍

ABclonal提供的免疫共沉淀(Co-IP)大致实验流程为:构建目标基因的质粒,共转细胞,在细胞裂解液中加入抗诱饵蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G,若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目标蛋白+诱饵蛋白+抗诱饵蛋白抗体+Protein A或G”,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。

实验原理


根据现实中免疫共沉淀实验目的的不同,ABclonal技术人员可协助客户设计实验方案,构建原核或真核表达质粒,利用标签蛋白抗体检测,无需额外购买或定制抗体,另外我们采用进口的免疫共沉淀试剂盒进行实验,protein A磁珠吸附效率高,我们实验成功率90%以上。

服务优势


  • 严格规范的SOP,确保实验过程无误。
  • 专业的数据分析,计算出浓度接近样本真实情况。
  • 完整的检测报告,包含真实的原始数据、专业结果分析、实验相关器材。
  • 2000种免费的抗体,专业的服务,为您降低科研成本!

服务承诺


  • 本公司会在最短的时间内快速将实验完成。
  • 本公司会根据总蛋白定量的结果,微调各个样本间浓度差异,高温变性,加入loading buffer,上样跑胶,以及转膜显色等步骤。
  • 本公司会利用软件对所得胶片进行扫描,用相对定量方法进行定量分析时,要对管家蛋白等参比蛋白进行同样操作,用所得到的值进行蛋白量的校正,最后求得目的蛋白的相对表达量。
  • 本公司会提供实验报告:包括详细的实验方法及western blot结果的相关图表。
  • 本公司保证检测结果准确、客观、可信,但不能确保一定要得到某特定结果。

客户提供


  • 客户须在实验开始前确保其细胞或组织中有目的蛋白的表达,并提供目的蛋白的相关信息(蛋白名称、大小等信息),尽可能详细的背景资料,包括蛋白的种属、大小、参考文献等。
  • 诱饵蛋白及目的蛋白的表达质粒,需测序验证,提供测序峰图文件。
  • 如无需ABclonal转染或转化的,则需提供含有诱饵蛋白及目标蛋白的裂解液5ml以上,如果为原核表达,则需要求蛋白务必为上清表达。
  • 客户应对所提供的材料及信息负责,如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或经济损失由客户承担
  • 如需使用诱饵蛋白及目标蛋白的特异性抗体检测,则需提供至少20ul以上特异性抗体。依据实验设计提供对应的诱饵Western blot实验结果及免疫共沉淀WB结果。保留原始的实验曝光胶片以及免疫共沉淀实验报告。
  • 新鲜样品(组织为100-150 mg/样,细胞>107 个/样),若为冻存样品,请于-70 ℃以下保存并自备液氮以便运输。一抗,标明来源和稀释度,也可让我司代买。
  • CO-IP所需要的目的蛋白的一抗,可自行提供,或在本公司购买相应指标。

技术路线

案例分析

案例1

案例2

案例3

案例4

案例5

案例6

案例7

常见问题

注意事项


  • 细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2% SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂。
  • 使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用。
  • 使用对照抗体:

    a) 单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

    b) 兔多克隆抗体:正常兔IgG

  • 使用对照抗体:

    a) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

    b) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

    c) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

常见问题


未检测到目的蛋白或蛋白很少:
可能原因   处理方法
样品被蛋白酶降解 添加蛋白酶抑制剂;所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融
抗体浓度太低 调整IP和/或IB抗体浓度, 必要时设立浓度梯度,摸索最佳浓度
抗抗体亲合力太低 选用适合于IP和/或IB的相应抗体
IP抗体未与agarose珠子结合 选用适合于IP的相应珠子, 正确保存防止变质或干燥
Tag未暴露在融合蛋白构象的表面 改变Tag融合表达部位
裂解液严谨度太高 换用低严谨度裂解液
目的蛋白高背景:
可能原因 处理方法
非特异蛋白结合 在无血清培养液中裂解细胞; 在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子预洗免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度(高盐或去垢剂)
裂解液严谨度太低 改用高严谨度裂解液
实验仪器或液体被污染 使用洁净的仪器或液体
转移膜上的非特异吸附 戴手套, 用镊子夹取, 不要接触膜转移面
报价表
  1. 您可以通过电子邮件、电话或在线与我们联系。
  2. 对于批量订单,请发送至邮箱cn.market@abclonal.com,欢迎电话垂询400-999-6126。