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T4 DNA连接酶(高浓度)

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货号: RK21500RM21500

浓度: 2,000,000 U/ml

规格:

优惠价
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产品描述

T4 DNA Ligase (T4 DNA连接酶),催化双链DNA或RNA的5’-磷酸基团与3’-羟基之间形成磷酸二酯键,该催化反应需ATP作为辅助因子。可以催化粘性末端分子间或平末端分子间的连接,也能修复双链DNA或DNA/RNA杂交双链上的单链DNA切口,同时T4 DNA连接酶会封闭这些DNA底物的缝隙。
本品适用于限制性内切酶酶切片段、Linker或Adaptor等的连接,也可以用于缺刻修复及Ligase介导的RNA检测。

产品组分

T4 DNA Ligase (High Conc.)RM21500
10X T4 DNA ligase Reaction BufferRM20108

产品信息

产品来源从T4 噬菌体来源的 T4 DNA Ligase基因在大肠杆菌中重组表达和多步纯化精制而成。
应用克隆连接, 接头连接
活性定义1活性单位(U)指λ DNA (经HindIII酶切,5'粘性末端DNA 浓度0.12 μM, 300 μg/mL) 在20 μL体系1X E.coli DNA Ligase Reaction Buffer中,16°C 30 min,连接50% DNA片段所需的酶量。
保存条件10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50% Glycerol, pH7.4 @ 25°C
保存温度-20°C
反应条件1X T4 DNA Ligase Reaction Buffer.
反应缓冲液或预混液1X T4 DNA Ligase Reaction Buffer:
50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, pH7.5 @ 25°C
热失活65°C 加热 10 min

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ABclonal连接酶常见Q&A

1、连接效率低的原因和解决方法?

A1:反应Buffer不合适:选择正确的反应Buffer。

A2:反应体系内无ATP等酶辅因子或Mg2+:使用随酶提供的反应Buffer或向其它兼容的Buffer中加入ATP。含ATP或NAD+的Buffer保存超过1年,其内ATP或NAD+可能会降解,导致连接失败。当补加ATP时,确定补加的是核糖核酸ATP(rATP),而不是脱氧核糖核酸ATP(dATP),因为后者不起作用。

A3:反应时间不足:按说明书推荐孵育时间操作,或者适当延长连接反应时间。

A4:连接反应温度不合适:建议在温控准确的设备中按酶最适反应温度进行反应。

A5:连接酶与酶底物选择不当:根据ABclonal推荐的连接酶选择指南,选择合适的连接酶。

A6:反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高:纯化DNA或RNA。

A7:去磷酸化步骤完成后,CIP、BAP或SAP失活不彻底:根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。

A8:连接末端为单碱基突出末端:提高连接酶使用量,延长反应时间。

A9:连接酶失活:使用经过验证的底物验证酶的活性。

2、用T4 DNA连接酶连接后转化失败的可能原因和解决办法?

A1:反应体系内无ATP或Mg2+:使用随酶提供的反应Buffer或向其它兼容的Buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年,其内ATP可能会降解,导致连接失败。当补加ATP时,确定补加的是rATP,而不是dATP,因为后者不起作用。

A2:反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高:纯化DNA。

A3:去磷酸化步骤完成后,CIP、BAP或SAP失活不彻底:根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。

A4:DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA:保持总DNA浓度在1-10 μg/mL之间。

A5:连接末端为单碱基突出末端:提高连接酶用量或者使用高浓度T4 DNA连接酶在16°C过夜连接。

A6:插入片段和质粒没有磷酸化:假如载体已经去磷酸化了,而引物又没有磷酸化会导致连接失败,订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。

A7:加入过多的连接混合物至感受态细胞:50 μL感受态细胞应加入1~5 μL连接混合物。

A8:插入片段太大,不能进行环化:降低插入片段的浓度,并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。

A9:T4 DNA连接酶失活:用HindIII酶切的λDNA或其它经过验证的底物进行检测。

A10:通过热失活以终止连接反应:连接反应完成后可直接进行转化,不需热失活终止连接,否则会显著降低转化效率。

A11:感受态细胞失活或者转化效率低:连接效率与感受态细胞状态呈正相关,实验前验证感受态细胞的转化效率。

A12:载体与连接片段比例不合适:对于单片段插入的连接反应,插入片段/线性化载体摩尔比在2-6时,连接效果最佳,低于2会显著降低连接效率,高于6会导致多片段连接的副反应,如果DNA浓度不确定(即摩尔比不确定),可能由于不同的摩尔比,导致不同的连接产物。

A13:电转的连接产物未纯化:若电转,连接产物需纯化后再进行电转化。

3、平端连接注意事项?

插入片段比载体片段的摩尔数更多;

加入更多的连接酶,最好使用高浓度的连接酶;

线性化载体需要进行去磷酸化处理;

15%的PEG8000可以提高连接效率和减少线性化载体自连;

反应体系控制尽量控制在10 μL;

去磷酸化步骤根据酶的性质而定,一般要反应一个小时,在反应半小时后补充酶再反应半小时;

插入片段与载体尽量使用限制性内切酶酶切完全;

低温长时间的连接效率比室温短时间连接的效果好,在4℃连接两天的效率比16℃连接过夜更高。

4、粘端连接注意事项?

连接反应的温度:DNA连接酶的最适反应温度为37℃,但在此温度下,粘性末端的氢键结合很不稳定,折衷方法是16℃连接过夜。

DNA的平未端和粘性末端:由于限制性内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端,因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。二者连接效率不同。粘性末端效率高,因而在底物浓度,酶浓度选择上是有差异的。

碱性磷酸酶处理的载体:为了提高连接效率,一般采取提高DNA的浓度,增加重组子比例。这样就会出现DNA 自生连接问题,为此通常选择对线性化载体用碱性磷酸酶处理,除去5’末端的磷酸基,防止环化,通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

连接反应的检测:连接反应成功与否,需要转化感受态细胞,通过阳性克隆的筛选来确定。如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效,可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功,则说明有效。

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