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ABScript II cDNA Fist-Strand Synthesis Kit (RK20400)

货号: RK20400

促销价:   ¥760
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产品信息

ABScript II cDNA First Strand Synthesis Kit包含ABScript II Enzyme Mix和ABScript II Reaction Mix两种经过优化的Mix。其中ABScript II Enzyme Mix包含了ABScript II逆转录酶和RNase抑制剂,而ABScript II Reaction Mix含有优化的反应Buffer。 ABScript II逆转录酶是一种重组M-MuLV逆转录酶,拥有较低的RNase H活性同时兼具增强的热稳定性。与野生型M-MuLV相比,重组M-MuLV逆转录酶可以在更高的温度下合成第一链cDNA。该酶在高达48℃时仍具有活性,特异性cDNA产量更高。
该试剂盒提供两种逆转录引物。Oligo-dT引物[d(T)23VN]迫使引物退火至Poly(A)尾的起始处。优化的Random Primer Mix 特异性较低,因此所有RNA,包括mRNA、rRNA、tRNA均可作为逆转录模板。本试剂盒可合成长达10 kb的cDNA。

产品特点
较低的RNase H活性利于长片段cRNA合成,可以合成长达10 kb的cDNA;
酶最适温度是42℃并且在48℃时仍具有较高的活性;
比普通M-MLV反转录酶(37℃)特异性cDNA产量更高;
适合新冠病毒检测;
配套多种RT引物,mRNA和ncRNA均能作为逆转录模板;

应用总RNA或者mRNA合成cDNA第一链,合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。
产品组分
  • ABScript II 酶预混液 (10X)RM21451
  • ABScript II 反应预混液 (2X)RM21450
  • Oligo d(T)23VN (50 uM)RM20115
  • 随机引物预混液 (60 uM)RM20116
  • dNTPs (10 mM) RM20120
  • 无核酸酶水RM20214
保存温度-20°C

FAQs

Q1:逆转录时,20 μL体系中RNA模板一般使用多少?加入的RNA量越多效果越好吗?

在20 μL逆转录体系中加入的总RNA模板控制在1 ng-1 μg和poly(A)-RNA控制在50 pg-100 ng时,逆转录效果最好。

逆转录体系中加入的RNA模板量也不是越多越好,需要控制在一定的范围内,当模板量过多时会抑制逆转录反应。

逆转录酶的适宜反应温度都是42°C,在42-48°C均有活性。但是对于某些GC含量高的基因或二级结构复杂的基因,在42°C不足以打开二级结构,使cDNA合成无法顺利进行,此时需要在高温65°C条件下使RNA模板/引物变性5 min以获得较好的结果。

ABclonal逆转录产品推荐的反应体系均是20 μL。

其他竞品的逆应体系基本也是20 μL。

客户可以按等比放大或缩小反应体系,但反应体系控制在10-50 μL,否则会影响逆转录效果。

现在市面上的RNA提取试剂盒中都含有基因组DNA去除步骤,所以逆转录产品一般可以不去基因组。如果考虑基因组DNA的污染,可以在qPCR的引物设计时跨内含子。如果引物设计未跨内含子,同时提取的RNA中有基因组DNA残留,此时需要在逆转录产品中需要增加去基因组DNA模块。

去基因组后效果不一定更好,如果DNase I降解DNA产生大量的寡核苷酸片段,可以作为qPCR反应的模板,会产生一些非特异性扩增。

RNase H高活性能够催化降解RNA/DNA杂交体中的RNA。RNase H低活性减少了第一链cDNA合成反应中RNA/DNA杂交体中模板RNA被降解,从而保证第一链cDNA的合成量和长度。

在逆转录反应前一定要电泳验证RNA的完整性,确认RNA没有降解。RNA模板不要保存时间太长,尽快进行逆转录及PCR操作。

通过变性琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性;RNA的A260/A280比值大于1.7;乙醇沉淀,然后70%乙醇洗涤可以除去大多数污染物,例如EDTA和胍类;用氯化锂沉淀可以去除多糖;苯酚/氯仿提取和乙醇提取可以去除蛋白污染,如蛋白酶;一些靶RNA可能包含RT的强终止序列; 建议使用随机引物而不是d(T)23VN;使用足量的RNA。

从cDNA进行基因克隆时,突变有可能发生在逆转录过程,也可能发生在PCR过程中。一般用高保真DNA聚合酶(如:KFX DNA聚合酶)进行扩增,控制较低的循环数;也可通过减少模板量、减少循环数降低突变几率。

RNA被降解:分离无污染、高质量的RNA;提取RNA的材料要尽量新鲜,RNA的A260/A280比值大于1.7。防止RNA降解,逆转录反应前,通过变性琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。RNA提取后,应保存在100%甲酰胺中。如果使用RNase抑制剂,逆转录温度应低于45°C,反应体系中pH低于8.0,否则抑制剂会释放所结合的RNase,而且,RNase抑制剂必须在0.8 mM DTT存在时才有活性。

RNA中包含逆转录反应的抑制剂:逆转录抑制剂包括SDS、EDTA、甘油、焦磷酸鈉、亚精胺、甲酰胺和肌盐等,将对照RNA和样品混合,进行产量比较,以检验是否有抑制剂。然后70%乙醇洗涤可以除去大多数污染物,例如EDTA和胍类;用氯化锂沉淀可以去除多糖;苯酚/氯仿提取和乙醇提取可以去除蛋白污染,如蛋白酶。

用于合成cDNA第一链合成的引物的退火不充分:确定逆转录温度适合实验所用的引物。对于随机引物,建议在反应温度前先在25°C处理10 min,对于基因特异性引物,可以试一下其他特异性引物或换用Oligo(dT)或随机引物。

起始RNA量较少:使用足量的RNA 模板。

一些靶RNA可能包含逆转录的强终止序列:建议使用随机引物而不是d(T)23VN。

目的序列在分析的组织中不表达:尝试其他组织。

PCR反应失败:对两步法q-PCR,cDNA模板不能超过反应体积的1/5。

引物和模板的非特异性退火:避免引物3΄端含有2到3个dG或dC。在第一链合成中使用基因特异性引物,而不是随机引物或Oligo(dT)。以逆转录的cDNA在qPCR中为模板,开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的遇火温度。使用热启动Taq DNA酶进行PCR,提高反应的特异性。

基因特异性引物设计较差:基因特异性引物设计与普通扩增引物设计采用相同的原则。

RNA中有基因组DNA的污染:使用扩增级(无宿主基因组残留)DNase I处理RNA,设置无逆转录酶对照实验检测基因组DNA污染。

形成引物二聚体:设计在3端没有互补序列的引物。

Mg2+浓度太高:对于每种模板和引物的组合,优化不同的镁离子浓度。

外源DNA气溶胶污染:使用带滤芯的枪头和UDG酶。

cDNA产物的含量过高:PCR反应体系中减少cDNA的加入量。

PCR反应中引物过多:减少引物的用量。

循环数过多:优化PCR反应条件,减少PCR的循环次数。

退火温度过低:提高退火温度,防止非特异性的起始及延伸。

DNase I降解DNA使产生的寡核苷酸片段作为模板产生的非特异性扩增:提取高质量RNA,防止被DNA污染(尽量提取无基因组残留的RNA)。

qPCR是将RNA先逆转录为cDNA,然后以cDNA作为模板进行靶标片段扩增。

用于逆转录的引物根据实验的具体情况选择随机引物,Oligo(dT)及基因特异引物的一种。对于短的不具有发卡结构的真核續胞mRNA三种引物都可。

随机引物:适用于长的具有发卡结构的RNA或一些含逆转录的强终止序列的靶RNA,适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的逆转录。主要用于单一模板的逆转录反应。

Oligo(dT)引物:适用于具有polyA尾巴的RNA。(原核生物的RNA,真核生物的rRNA和tRNA不具有polyA尾巴。)由于Oligo(dT)要结合到polyA尾巴上,所以对RNA样品的质量要求较高,即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

基因特异引物:能与模板序列互补,适用于目的序列已知的逆转录。

内参法:理论上,逆转录的cDNA是长度不同的DNA片段,所以电泳条带应该均匀分布在泳道上,如果RNA丰度低,电泳检测也可能无产物,这种情况通过PCR扩增内参基因,如果有扩增产物,cDNA的质量基本上可以保证(少数情况下:如目的基因片段过长,可能会有例外)。

已知基因扩增法:如果有已知以此模板扩出来的基因,可以用此基因的引物验证。能扩增出内参,不一定就说明cDNA没有问题。因为内参在cDNA中丰度高,很容易扩出。如果cDNA因为各种原因导致部分降解,从几率的角度讲,就会大大影响低丰度的目的基因的PCR结果,而内参因为依然是高丰度,扩增很可能不受影响。

RNA部分降解,检测提取RNA的完整性及纯度

不同物种的RNA情况可能不一样,但一般提取成功的总RNA在凝胶电泳中应包含两条清晰的28S和18S rRNA条带,并且前者条带的亮度应是后者的2倍,出现5S带代表RNA发生了降解,其亮度与降解程度成正比。内参基因扩增效果好并不能说明RNA质量优异,因为内参的表达量大,只要是RNA降解的不严重都可以有较好的扩增。分光光度计测的纯RNA的A260/A280的比值应控制在1.9-2.1,提取的RNA有少量蛋白污染会使比值降低,但只要A260/A280的比值大于1.7就不会影响逆转录,最重要的是RNA的完整性。

RNA是否降解严重以及逆转录是否成功:一般情况下,内参基因无扩增很大部分原因是RNA模板严重降解,另一个可能是逆转录失败。虽然内参不能作为判断cDNA质量的标准,但在使用高质量RNA模板的情况下却可以作为逆转录是否成功的标准。

扩增内参基因的引物是否可靠以及PCR所用的试剂有无问题。

一步法RT-PCR即逆转录与PCR扩增在同一个体系内完成。这有助于减少污染几率。由于得到的所有cDNA样品都用来扩增,所以灵敬度更高,最低可以使用0.01 pg的总RNA。成功的一步法RT-PCR,一般使用基因特异性引物起始cDNA合成。

两步法RT-PCR即逆转录和PCR扩增分两步进行,首先进行RNA逆转录得到cDNA,然后以cDNA为模板进行qPCR反应,两步法可以使用Oligo(dT)或随机引物进行cDNA合成,可以从一个特定的样品中逆转出所有mRNA的信息。

总的来说,一步法更方便,可适用于大量样品分析或定量PCR。两步法在选择聚合酶和引物时具有更大的灵活性,但需要注意的是,一步法中由于逆转录与PCR反应在同一反应体系中进行,使用同一反应Buffer两者反应条件不能进行同时优化,且逆转录步骤在一些PCR反应Buffer中效率很低,因此一般不推荐使用。

目的建议
逆转录与PCR使用不同的引物两步法RT-PCR
高灵敏一步法RT-PCR
高特异性高特异性两步法RT-PCR
高保真度高保真度两步法RT-PCR
长的逆转录产物长片段扩增的两步法RT-PCR

文献引用 (32)

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