产品介绍

爱博泰克自主开发的T细胞活化试剂盒，其主要原理是通过模拟T细胞表面的CD3和CD28受体与抗原结合的双信号作用，引发T细胞的激活和增殖。该试剂盒包含CD3和CD28单克隆抗体，能够激活CD3和CD28信号通路，促使T细胞进行增殖、分泌细胞因子等反应，从而增强免疫反应。

Human T Cell Activation Kit (Anti-CD3/CD28) 货号RK40100
试剂盒组分 货号 名称
CD3 A25761 Mouse anti-Human CD3 mAb
CD28 A27700 Rabbit anti-Human CD28 mAb
Mouse T Cell Activation Kit (Anti-CD3/CD28) 货号RK40101
试剂盒组分 货号 名称
CD3 A27913 Armenian Hamster anti-Mouse CD3 mAb
CD28 A27914 Syrian Hamster anti-Mouse CD28 mAb

核心优势

高效激活

经细胞水平验证，可高效激活扩增T细胞。

低内毒素

试剂盒中的抗体生产时均经过除菌和去内毒素处理，超低内毒素（< 1EU/mg），对T细胞无伤害从而提高实验的准确性和可靠性。

操作简便

试剂盒的使用步骤相对简便，无需复杂的操作过程，即可实现T细胞的激活和扩增。

验证数据

Human T Cell Activation Kit收起
T细胞活化刺激细胞形态观察

对比后结论：

分别在0 h、24 h和48 h对未刺激组和刺激组进行镜检（40x），观察细胞形态。可以看到，经过激活试剂刺激后，细胞明显增多，说明细胞增殖变快。

刺激72 h流式对标检测结果

对比后结论：

未刺激组：细胞活化程度低，活化T细胞数量少。
ABclonal激活组：细胞活化程度与竞品组相似，活化T细胞数量也显著增加，活化程度略高于竞品激活组。

Mouse T Cell Activation Kit收起
T细胞活化刺激细胞形态观察

对比后结论：

分别在0 h、24 h和48 h对未刺激组和刺激组进行镜检（40x），观察细胞形态。可以看到，经过激活试剂刺激后，细胞明显增多，说明细胞增殖变快。

刺激72 h流式对标检测结果

对比后结论：

未刺激组：细胞活化程度低，活化T细胞数量少。
ABclonal激活组：细胞活化程度与竞品组相似，活化T细胞数量也显著增加，活化程度与竞品激活组基本一致。

操作步骤

  • 人T细胞激活和扩增
  • 小鼠T细胞激活和扩增
材料准备收起
  • 细胞材料：人新鲜抗凝血
  • 培养基与试剂：RPMI 1640培养基，L-谷氨酰胺，10%胎牛血清，抗生素，Ficoll密度梯度分离液，PBS，rhIL-2 (ABclonal#RP01039)，抗 CD3、CD28 抗体（ABclonal#RK40100）。
  • 检测工具：流式细胞仪，细胞计数板等。
  • 实验设备：CO2培养箱，离心机，显微镜等。
样本制备收起
PBMCs的分离与准备
  • 人PBMCs分准备：确保采集的抗凝全血不超过8小时，使用适当的抗凝剂（如柠檬酸钠或肝素）。
  • 密度梯度离心：从4℃冰箱取出Ficoll分离液，恢复至室温。向15ml离心管中加入全血体积的Ficoll分离液。
  • 血液稀释与加载：全血与PBS按1:1比例稀释，轻轻混匀。小心且缓慢地将稀释后的血液沿离心管壁加入，避免破坏Ficoll层与血液的界面。Ficoll分离液，PBS和血液的总体积不要超过离心管容量的2/3 。
  • 离心：20℃，400 g，25 min，升速为1降速为0，将上述离心管小心转移到离心机中离心。
  • 收集PBMCs：离心后，血样会分为明显的几层：上层为血浆，中间为PBMC层（呈现为“白膜”），下层为红细胞和粒细胞。使用无菌吸管小心吸取中间的PBMC层，尽量避免吸到上层的血浆或下层的红细胞。
  • 洗涤：向含有PBMC的离心管中加入适量的PBS或培养基，充分混匀后再次离心，400 g 5min，以去除残留的血浆、Ficoll和碎片。去除上清，重复洗涤步骤一次。
  • 细胞计数与调整密度：用适量的培养基（RPMI 1640，含2 mM L-谷氨酰胺，10%FBS）轻轻重悬PBMC，进行细胞计数，调整细胞浓度至3E6/mL。
T细胞激活收起
  • 抗原包被：用无菌PBS稀释CD3（ABclonal#RK40100）抗体到指定浓度，然后加入到24孔板中，保证孔板底部被覆盖。放到37℃细胞培养箱中静置包被2 h。
  • 细胞接种：将调整好细胞密度的PBMCs转移到摇瓶中，加入指定浓度的CD28（ABclonal#RK40100）抗体在细胞培养箱中孵育2 h。
  • 培养：CD3抗体包被完成后吸弃包被的液体，将与CD28抗体共孵育的PBMCs加入到孔中，每孔1 mL细胞液。将培养板放入 5% CO2培养箱中，在 37°C 下培养 1-3 天。第 1 天，细胞会产生转录因子和细胞因子。大多数 T 细胞会在 3 天内分裂，形成克隆团。培养基中需含有IL-2(100U/mL；20ng/mL,  ABclonal#RP01039)以维持细胞活性和生长，第三天的时候可视细胞密度半换液（IL-2现用现加，CD3/CD28抗体不需要加）。
流式检测收起
  • 将细胞重悬于PBS中，调整细胞浓度至1×10⁶/mL。
  • 每管加入100 μL细胞悬液（约1×10⁵细胞），加入适量的荧光标记抗体（ABclonal#A27177, ABclonal#A26773，ABclonal#A25892 根据抗体说明书调整）。
  • 避光孵育15 - 30分钟，4℃。
  • 加入2 mL PBS洗涤细胞，2000 rpm离心5分钟，弃上清。
  • 重复洗涤一次，重悬细胞于200 μL PBS中，上机检测。
材料准备收起
  • 细胞材料：5-10周龄的C57BL/6雌性小鼠
  • 培养基与试剂：RPMI 1640培养基，L-谷氨酰胺，10%胎牛血清（gibco FBS），抗生素，Ficoll密度梯度分离液，PBS，mIL-2（ABclonal#RP01384），抗 CD3抗体，抗 CD28 抗体（ABclonal#RK40101）。
  • 检测工具：流式细胞仪，细胞计数板等。
  • 实验设备：CO2培养箱，离心机，显微镜等。
样本制备收起
脾脏/淋巴结的分离与准备
  • 将小鼠处死后，从小鼠身上获取脾脏和淋巴结(颈浅、下颌、腋窝、腹股沟和肠系膜)，分开到两个皿中。因为淋巴结不需要红细胞裂解，否则容易导致部分白细胞死亡。
  • 在无菌条件下将脾脏和淋巴结进行剪碎、研磨、过滤、离心和重悬。脾细胞还要单独进行裂红处理，以去除其中的红细胞。
  • 取出脾脏和淋巴结置于装有20 mL 含1×P/S的RPMI1640 培养基的10 cm 平皿中；
  • 将脾脏和淋巴结置于75 μm 细胞过滤筛中，使用研磨棒将过滤筛中的脾脏研磨成单一的细胞(注意：边研磨边移动细胞过滤筛，并使用培养基冲洗细胞过滤筛，以便于细胞分散于培养基中);
  • 将含有细胞的培养基移入50 mL 离心管中，并使用新的培养基冲洗平皿，同样将培养基移入离心管中，培养基总量不超 过30 mL;
  • 脾脏裂红处理（淋巴结不需要红细胞裂解）：室温离心400 g×5 min, 去上清，留细胞，加入13 mL常温的红细胞裂解液进行红细胞裂解，用移液器轻柔 吹散细胞团后计时1 min, 加入基础培养基37 mL, 混匀，终止红细胞裂解；
  • 室温离心400 g×5 min, 去上清，留细胞，加入40 mL 常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗；
  • 室温离心400 g×5 min, 去上清，留细胞，加入20 mL 常温放置的20% FBS 培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，并将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞；
  • 室温离心400 gx5 min, 弃去上清；
  • 加入20 mL完全培养基 (RPMI1640+10%FBS+1×P/S) 重悬细胞，准备细胞计数。
T细胞激活收起
  • Day0，用无菌PBS稀释anti-mouse CD3ε（ABclonal#RK40101）至终浓度2 μg/ml包被24孔板，0.5ml抗体/孔，37℃静置2h。
  • 小鼠T细胞的完全培养基为：RPMI 1640+10% gibco FBS+1% Pen/Strep+50uM β-巯基乙醇+1mM HEPES。将上步骤得到的细胞用完全培养基重悬至密度5E5/ml（未经富集的细胞密度提升至1.5E6/ml）后，吸弃包被后的抗体并将细胞悬液加入到包被好的孔板中，1 ml细胞悬液/孔。
  • 向细胞悬液中加入anti-mouse CD28（2 μg/ml，ABclonal#RK40101），mIL-2(100 U/ml；20 ng/ml, ABclonal#RP01384)，置于37℃培养，72 h后可以视细胞密度进行换液或者补液，只需在完全培养基的基础上加入同终浓度的IL-2。
  • 培养3-5天后可以观察细胞成团情况，以及流式检测CD25,CD69等指标。
流式检测收起
  • 将细胞重悬于PBS中，调整细胞浓度至1×10⁶/ml。
  • 每管加入100 μl细胞悬液（约1×10⁵细胞），加入适量的荧光标记抗体（ABclonal#A28704，ABclonal#A23808，ABclonal#A26449根据抗体说明书调整）。
  • 避光孵育15 - 30分钟，4℃。
  • 加入2 ml PBS洗涤细胞，400 g离心5分钟，弃上清。
  • 重复洗涤一次，重悬细胞于200 μl PBS中，上机检测。