对于石蜡包埋的组织、活检手术切除标本应在2小时内取材或固定,避免组织自溶及抗原变性等影响免疫组化效果。对于冰冻切片的组织,取材后应立即放入液氮冷冻,然后放入-80℃保存。
Q1:石蜡切片和冰冻切片的比较?
Q2:一抗的选择要点和技巧是什么?
Q3:在什么情况下使用Triton-X100?
Q4:封闭血清的选择原则是什么?
Q5:抗体孵育条件的比较?
Q6:一抗4℃孵育后为什么要进行37℃复温?
Q7:DAB显色时间如何把握?
Q8:免疫组化结果如何分析?
Q9:在什么情况下进行组织抗原修复,抗原修复的条件是什么?
Q10:内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么?
Q11:如何才能充分脱蜡?
Q12:如何最大限度地降低组织非特异性染色?
Q13:苏木素复染时间的控制?
Q14:PBS的清洗方式选择、次数和时间的选择?
临床上每天检测的病例很多,所用的抗体种类及项目也多,如果在加入一抗孵育完后,将它们在一个缸内洗,这样就会造成交叉污染,影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗,冲洗的PBS为一次性,保证切片没有相互交叉污染的机会。
冲洗切片,取出切片,将PBS从上轻轻地冲洗,让PBS自上而下流下来,不要拿起切片将PBS对准切片冲洗,这样由于冲出的PBS有一定的冲击力,很容易使切片周边引起松动,导致切片的脱落。
冲洗切片有人提出用微振荡器振染,振下未结合的各种物,使之不产生背景,此种做法一是浪费时间,二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为,用一小烧杯柔和地于切片上冲洗,就能彻底冲洗去未结合的物质,无需附加其它条件,冲洗好于切片上再注入PBS,持续2分钟左右就完全足够了。
刘彦仿指出:中性及弱硷性条件(pH7-8)有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解。[]免疫组化P56我们目前常用的PBS的pH在7.4-7.6浓度是0.01M,根据本室十几年来的使用情况,认为该溶液价格便宜配制方面,使用效果好。
在免疫组织化学的染色过程中,用得最多的试剂就是缓冲液,因为切片在整个染色中,抗体的加、换、切片的冲洗,DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用,缓冲液的过酸或偏碱,都将影响染色的结果。
Q15:脱片产生的原因和如何防止脱片?
Q16:背景染色较深的原因有哪些?
一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是,每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试,使每一抗体个体化,找到适合自己实验室的理想工作浓度,既使是即用型的抗体也应如此,不能只简单的按说明书进行染色。
解决办法是,严格执行操作规程,最好随身佩带报时表或报时钟,及时提醒,避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法(Polymer)敏感性很高,要求一抗孵育的时间不是传统的1小时,而是30分钟,因此,要根据染色结果进行调整。
DAB最好现用现配,如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长,因为在没有酶的情况下,过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力,未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控,达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时,这样做似乎不现实,但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控,避免显色时间过长。
修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细,采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈,可以有效的避免液体流失,也能提高操作速度。
原因上不清楚,但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复,第二天加抗体进行免疫组化染色,如果将装有切片和修复液的容器放在4?C冰箱过夜,对结果无明显影响,如果放在室温,特别是炎热的夏天,会出现背景着色,因此,不可存放时间太长。
注意抗体的有效期,过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
Q17:苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长?
返蓝可以用碱性溶液(PBS/NA2HPO4/淡氨水)或45度温水、冷水蓝化均可。一般蓝化5~10 min。淡氨水有人用50ml自来水+三四滴的氢氧化铵。