• 1、细胞材料：5-10周龄的C57BL/6雌性小鼠
• 2、培养基与试剂：RPMI 1640培养基，L-谷氨酰胺，10%胎牛血清（gibco FBS），抗生素，Ficoll密度梯度分离液，PBS，mIL-2（ABclonal#RP01384），抗 CD3抗体，抗 CD28 抗体（ABclonal#RK40101）。
• 3、检测工具：流式细胞仪，细胞计数板等。
• 4、实验设备：CO2培养箱，离心机，显微镜等。

PBMCs的分离与准备

• 1、将小鼠处死后，从小鼠身上获取脾脏和淋巴结(颈浅、下颌、腋窝、腹股沟和肠系膜)，分开到两个皿中。因为淋巴结不需要红细胞裂解，否则容易导致部分白细胞死亡。
• 2、在无菌条件下将脾脏和淋巴结进行剪碎、研磨、过滤、离心和重悬。脾细胞还要单独进行裂红处理，以去除其中的红细胞。
• 3、取出脾脏和淋巴结置于装有20 mL 含1×P/S的RPMI1640 培养基的10 cm 平皿中；
• 4、将脾脏和淋巴结置于75 μm 细胞过滤筛中，使用研磨棒将过滤筛中的脾脏研磨成单一的细胞(注意：边研磨边移动细胞过滤筛，并使用培养基冲洗细胞过滤筛，以便于细胞分散于培养基中);
• 5、将含有细胞的培养基移入50 mL 离心管中，并使用新的培养基冲洗平皿，同样将培养基移入离心管中，培养基总量不超 过30 mL;
• 6、脾脏裂红处理（淋巴结不需要红细胞裂解）：室温离心400 g×5 min, 去上清，留细胞，加入13 mL常温的红细胞裂解液进行红细胞裂解，用移液器轻柔 吹散细胞团后计时1 min, 加入基础培养基37 mL, 混匀，终止红细胞裂解；
• 7、室温离心400 g×5 min, 去上清，留细胞，加入40 mL 常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗；
• 8、室温离心400 g×5 min, 去上清，留细胞，加入20 mL 常温放置的20% FBS 培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，并将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞；
• 9、室温离心400 gx5 min, 弃去上清；
• 10、加入20 mL完全培养基 (RPMI1640+10%FBS+1×P/S) 重悬细胞，准备细胞计数。

• 1、Day0，用无菌PBS稀释anti-mouse CD3ε（ABclonal#RK40101）至终浓度2 μg/ml包被24孔板，0.5ml抗体/孔，37℃静置2h。
• 2、小鼠T细胞的完全培养基为：RPMI 1640+10% gibco FBS+1% Pen/Strep+50uM β-巯基乙醇+1mM HEPES。将上步骤得到的细胞用完全培养基重悬至密度5E5/ml（未经富集的细胞密度提升至1.5E6/ml）后，吸弃包被后的抗体并将细胞悬液加入到包被好的孔板中，1 ml细胞悬液/孔。
• 3、向细胞悬液中加入anti-mouse CD28（2 μg/ml，ABclonal#RK40101），mIL-2(100 U/ml；20 ng/ml, ABclonal#RP01384)，置于37℃培养，72 h后可以视细胞密度进行换液或者补液，只需在完全培养基的基础上加入同终浓度的IL-2。
• 4、培养3-5天后可以观察细胞成团情况，以及流式检测CD25,CD69等指标。

• 1、将细胞重悬于PBS中，调整细胞浓度至1×10⁶/ml。
• 2、每管加入100 μl细胞悬液（约1×10⁵细胞），加入适量的荧光标记抗体（ABclonal#A23322，ABclonal#A23808，ABclonal#A26449根据抗体说明书调整）。
• 3、避光孵育15 - 30分钟，4℃。
• 4、加入2 ml PBS洗涤细胞，400 g离心5分钟，弃上清。
• 5、重复洗涤一次，重悬细胞于200 μl PBS中，上机检测。