Western blot analysis of extracts of various cell lines, using ALDH1A1 antibody (A1802) at 1:1000 dilution.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25ug per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 20s.
Immunohistochemistry of paraffin-embedded rat liver using ALDH1A1 antibody (A1802) at dilution of 1:100 (40x lens).
Immunohistochemistry of paraffin-embedded human colon carcinoma using ALDH1A1 antibody (A1802) at dilution of 1:100 (40x lens).
Immunohistochemistry of paraffin-embedded mouse brain using ALDH1A1 antibody (A1802) at dilution of 1:100 (40x lens).
d. Nitrocellulose membrane（RM00017/ RM02801/ RM00018）
4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂
a. 1XTBST Buffer（RM00013）
b. 1X Western Blocking Buffer（RK05742）
c. Skimmed milk powder（RM00014）
d. Bovine Serum Albumin (BSA)（RM02802）
e. Western Antibody Dilution Buffer（RK05743）
f. HRP 偶联二抗（AS014/AS003）
g. SignalFire™ ECL Reagent（RM00020/RM00021）
二、实验步骤
1、样品制备
（1）细胞收集
a. 贴壁培养细胞收集
去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养基清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
b. 悬浮培养细胞收集
速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。手指轻弹细胞，使其松散。
c. 组织样本收集
把组织剪切成细小的碎片，越小越好。取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。
（2）总蛋白提取
a. 细胞/组织裂解
将装有细胞沉淀或组织碎片的容器完全插入冰中。细胞沉淀按照1mL裂解液/107个细胞(1个T75培养瓶细胞量)的比例加入相应体积的裂解液（细胞量足够时都加入3mL，不足时根据细胞量计算），裂解20min，每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s。组织碎片按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重复5次，使组织尽量碾碎。（裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂）。
b. 离心
把裂解好的样品配平后，置于预冷的高速冷冻离心机中，12000 rpm，15min。
c. 蛋白变性
完成离心后，上清即为蛋白提取液。吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入1/4上清体积的5×Loading Buffer（最终工作液为1X)，待干式恒温器温度升至95℃后，将1.5mL离心管插入加热孔中，95℃加热变性10min，待液体完全冷却后置于-20℃保存。
（3）蛋白浓度测定（BCA法）
a. BCA工作液的配置
根据样品数量，按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B（50:1）配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。
b. 标准品测定
取10μl蛋白标准品（5mg/ml BSA）稀释至50μl，使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1*PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中，加稀释液补足到20μl（见附表）。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，如果样本不足20μl，需加稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
b. 根据胶体大小选择,将Filter Paper及Nitrocellulose membrane剪裁至合适尺寸。
c. 目的蛋白＞20KD选择0.45μm NC膜；目的蛋白＜20KD选择0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜，选择完毕后将NC膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用，注意如使用的是PVDF膜需先放入甲醇中浸泡5-10min，再放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。
a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
b. 封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中，室温2h或4℃过夜。
6、洗涤
一抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。
7、二抗孵育
a. 一抗洗涤结束前10min，将二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
b. 洗涤结束后，将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中，室温1h。
8、洗涤
二抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。
9、曝光
a. 根据膜的大小，按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液，按比例吸取等体积的 SolutionⅠ和 SolutionⅡ混匀，配制成发光检测工作液。
b. 用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上，使其均有覆盖，室温孵育 1-2min，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
c. 压片检测：将膜固定于片夹内。暗室内压片 1 分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30 秒、1、3、 5 分钟，然后一起显影定影观察结果。
d. 荧光成像仪检测：将膜放置到荧光成像仪内，参考仪器说明书进行检测。
附表1：BSA标准品稀释
1mg/ml BSA(μl)
稀释液(μl)
对应的蛋白含量（mg/ml）
0
20
0
1
19
0.05
2
18
0.1
4
16
0.2
8
12
0.4
12
8
0.6
16
4
0.8
20
0
1
附表2：分离胶浓度的选择
分子量（kDa)
分离胶浓度
X≤10
15%
10<X≤15
13.5%
15<X≤25
12%
25<X≤35
11%
35<X≤40
10%
40<X≤55
9%
55<X≤70
8%
70<X≤100
7%
100<X
6%
备注：X为目的蛋白大小
附表3：分离胶配制
分离胶浓度
6%
7%
8%
9%
10%
11%
12%
13.5%
15%
去离子水（mL）
5.3
4.9
4.6
4.3
4.0
3.65
3.3
2.8
2.3
30%丙烯酰胺 （mL）
2
2.4
2.7
3.0
3.3
3.65
4.0
4.5
5.0
1.5M Tris-HCL(pH8.8) （mL）
2.5
10%SDS（mL）
0.1
10%AP（mL）
0.1
TEMED（mL）
0.01
总体积（mL）
10
附表4：浓缩胶配制
5%浓缩胶
5%浓缩胶
5%浓缩胶
5%浓缩胶
5%浓缩胶
去离子水（mL）
1.1
2.1
2.7
3.4
4.1
30%丙烯酰胺 （mL）
0.33
0.5
0.67
0.83
1.0
1.0M Tris-HCL(pH6.8) （mL）
0.25
0.38
0.5
0.63
0.75
10%SDS（mL）
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
10%AP（mL）
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
TEMED（mL）
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
总体积（mL）
2
3
4
5
6
附表5：转膜条件选择
分子量（kDa)
转膜条件
X≤10
恒流200mA,30min
10 < X≤15
恒流200mA,40min
15< X≤20
恒流200mA,50min
20< X≤50
恒流200mA, 1kDa/min+20min
50< X≤100
恒流200mA, 1kDa/min+30min
100< X≤150
恒流250mA, 1kDa/min+20min
150< X≤180
恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在3h内)
180< X
恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在4h内)
备注：X为目的蛋白大小
IP检测
一、实验试剂
（1）rProtein A/G Plus MagPoly Beads（RM09008）
（2）裂解液&洗杂液：Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)（RM00022）
（3）蛋白酶抑制剂
（4）封闭液：含 3% BSA 的 1X PBS
（5）1×PBS 缓冲液(RM00012)
（6）5×loding buffer（RM00001）（使用时用去离子水稀释至工作浓度即可）
（7）Control IgG （AC005/ AC011/AC034）
二、实验步骤
1、样本处理
（1）贴壁培养细胞
a. 取裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
b. 去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养基清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
c. 按照6孔板每孔加入100~200μl裂解液的比例，加入裂解液。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液作用于细胞1~5s内，细胞会被裂解。
d. 1000~12000g，离心3~5min（如果用冷冻离心机4℃效果更佳），取上清。
（2）悬浮培养细胞
a. 取裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
b. 速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
c. 手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔加入100~200μl裂解液的比例，加入NP-40裂解液。通常6孔板每孔加入100~200μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量150~200μl，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应无明显沉淀。
d. 1000~12000g，离心3~5min（如果用冷冻离心机4℃效果更佳），取上清。
（3）组织样本
a. 取裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
b. 把组织剪切成细小的碎片，越小越好。
c. 取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。
d. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30-60min。（步骤3、4也可采用以下过程：按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例加入NP-40裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。）
e. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例，加入裂解液。
f. 1000~12000g，4℃离心10~15min（如无低温离心机，室温下离心也可），取上清。
2、磁珠预处理
（1）将rProtein A/G Plus MaqPoly Beads颠倒或漩涡混匀，翻转瓶身发现底部无黑色沉淀即可。
（2）取30μl rProtein A/G Plus MaqPoly Beads至新的EP管中，放在磁分离器上，待溶液澄清后，用移液器吸弃保护液。
（3）将EP管从磁分离器上取下来，加入1ml Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)，混匀，放置在磁分离器上，收集磁珠，用移液器吸弃洗杂液，重复2次。
The protein encoded by this gene belongs to the aldehyde dehydrogenase family. Aldehyde dehydrogenase is the next enzyme after alcohol dehydrogenase in the major pathway of alcohol metabolism. There are two major aldehyde dehydrogenase isozymes in the liver, cytosolic and mitochondrial, which are encoded by distinct genes, and can be distinguished by their electrophoretic mobility, kinetic properties, and subcellular localization. This gene encodes the cytosolic isozyme. Studies in mice show that through its role in retinol metabolism, this gene may also be involved in the regulation of the metabolic responses to high-fat diet.
