反应物种 | Human, Mouse, Rat |
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产品应用 | WBIHCIFIP |
推荐稀释比 |
|
理论分子量 | 62kDa |
实际分子量 | 62kDa |
存储缓冲液 | Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles. Buffer: PBS with 0.02% sodium azide,0.05% BSA,50% glycerol,pH7.3. |
阳性样本 | HeLa,HepG2,293T,mouse liver,mouse brain |
细胞定位 | Cytoplasm,Cytoplasmic vesicle,Endoplasmic reticulum,Late endosome,Lysosome,Nucleus,P-body,autophagosome |
纯化方式 | Affinity purification |
应用及物种 | WB (Mus musculus , Homo sapiens) |
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免疫原 | A synthesized peptide derived from human SQSTM1 / p62. |
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序列 | Email for sequence |
一、实验试剂及耗材
二、实验步骤
(1)细胞收集
(2)总蛋白提取
(3)蛋白浓度测定(BCA法)
(1)制胶器安装
(2)分离胶制备
(3)浓缩胶制备
(4)上样
(5)电泳
(1)准备工作
(2)转膜
附表1:BSA标准品稀释
1mg/ml BSA(μl) | 稀释液(μl) | 对应的蛋白含量(mg/ml) |
---|---|---|
0 | 20 | 0 |
1 | 19 | 0.05 |
2 | 18 | 0.1 |
4 | 16 | 0.2 |
8 | 12 | 0.4 |
12 | 8 | 0.6 |
16 | 4 | 0.8 |
20 | 0 | 1 |
附表2:分离胶浓度的选择
分子量(kDa) | 分离胶浓度 |
---|---|
X≤10 | 15% |
10<X≤15 | 13.5% |
15<X≤25 | 12% |
25<X≤35 | 11% |
35<X≤40 | 10% |
40<X≤55 | 9% |
55<X≤70 | 8% |
70<X≤100 | 7% |
100<X | 6% |
附表3:分离胶配制
分离胶浓度 | 6% | 7% | 8% | 9% | 10% | 11% | 12% | 13.5% | 15% |
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去离子水(mL) | 5.3 | 4.9 | 4.6 | 4.3 | 4.0 | 3.65 | 3.3 | 2.8 | 2.3 |
30%丙烯酰胺 (mL) | 2 | 2.4 | 2.7 | 3.0 | 3.3 | 3.65 | 4.0 | 4.5 | 5.0 |
1.5M Tris-HCL(pH8.8) (mL) | 2.5 | ||||||||
10%SDS(mL) | 0.1 | ||||||||
10%AP(mL) | 0.1 | ||||||||
TEMED(mL) | 0.01 | ||||||||
总体积(mL) | 10 |
附表4:浓缩胶配制
5%浓缩胶 | 5%浓缩胶 | 5%浓缩胶 | 5%浓缩胶 | 5%浓缩胶 | |
---|---|---|---|---|---|
去离子水(mL) | 1.1 | 2.1 | 2.7 | 3.4 | 4.1 |
30%丙烯酰胺 (mL) | 0.33 | 0.5 | 0.67 | 0.83 | 1.0 |
1.0M Tris-HCL(pH6.8) (mL) | 0.25 | 0.38 | 0.5 | 0.63 | 0.75 |
10%SDS(mL) | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 |
10%AP(mL) | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 |
TEMED(mL) | 0.002 | 0.003 | 0.004 | 0.005 | 0.006 |
总体积(mL) | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
附表5:转膜条件选择
分子量(kDa) | 转膜条件 |
---|---|
X≤10 | 恒流200mA,30min |
10 < X≤15 | 恒流200mA,40min |
15< X≤20 | 恒流200mA,50min |
20< X≤50 | 恒流200mA, 1kDa/min+20min |
50< X≤100 | 恒流200mA, 1kDa/min+30min |
100< X≤150 | 恒流250mA, 1kDa/min+20min |
150< X≤180 | 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在3h内) |
180< X | 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在4h内) |
一、实验试剂
二、实验步骤
(1)贴壁培养细胞
(2)悬浮培养细胞
(3)组织样本
(1)变性洗脱(此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。)
(2)非变性洗脱
一、实验试剂
二、实验步骤
(1)反应体系 (20ul)
DNA模板: | 5 μl |
引物: | 5 μl |
Green Master Mix: | 10 μl |
(2)反应体系 (20ul)
Stage 1 | 预变性 | Reps: 1 | 95 ℃ | 5 min |
Stage 2 | 循环反应 b | Reps: 40 | 95 ℃ | 10 sec |
60 ℃ | 30 sec | |||
Stage 3 | 融解曲线 | Reps: 1 | 95 ℃ | 15 sec |
60 ℃ | 60 sec | |||
95 ℃ | 15 sec |
假设 Input 起始浓度为 a,Ct1 个循环数扩增后达到阈值;IgG 起始浓度为 b,Ct2 个循环数扩增后达到阈值;目的蛋白起始浓度为 c,Ct3 个循环数扩增后达到阈值。则可以得到如下公式:
a×2Ct1 = b×2Ct2 = c×2Ct3 | |
b/a = 2Ct1/2Ct2 = 2(Ct1-Ct2) | b:a=2(Ct1-Ct2) |
c/a = 2Ct1/2Ct3 = 2(Ct1-Ct3) | c:a=2(Ct1-Ct3) |
检测结果=2(Ct1-Ct3)/2(Ct1-Ct2) |
一、实验仪器试剂和耗材
二、实验步骤
Dot Blot检测采用NC膜,取NC膜裁成6.5cm宽长条,并在其上画长宽为1cm×1cm正方形小格(在膜上面的蓝色纸上画,画格时膜(白色)与蓝色纸必须完全重叠,让蓝色纸上的正方形小格能在膜上留下正确的划痕)。
将不同浓度的多肽稀释为成50ng/ul(稀释为需要的浓度即可)。
揭开膜上面的蓝色保护纸,用移液器吸取50ng/μL多肽稀释液2ul点在膜上1cm×1cm正方形小格中心,即多肽包被量为100ng(包被量根据需求调整)。点样完成后,将NC膜放入37℃烘箱中30min。
把膜放入相应的大小的抗体孵育容器中,加入适量Blocking Buffer室温封闭1h。
封闭结束10min前,用Antibody Dilution Buffer稀释一抗备用。封闭结束后去除封闭液,加入稀释好的一抗工作液,室温2h或4℃过夜。
去除一抗工作液,加入适量TBST Buffer洗杂4次,5min/次。
洗杂结束前10min,用Antibody Dilution Buffer稀释二抗备用。去除TBST Buffer,加入稀释好的二抗工作液,室温1h。
去除二抗工作液,加入适量TBST Buffer洗杂4次,5min/次。
一、实验仪器及试剂
微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、光学显微镜、移液器、孵育湿盒、抗原修复盒。
试剂名称 | 1*PBS/L | 试剂名称 | 1*PBST/L |
NaH2PO4 | 0.23g | 1*PBS溶液 | 1L |
Na2HPO4 | 1.15g | Tween 20 溶液 | 0.001L |
NaCl | 8.5g | 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值 |
二、实验步骤
一、实验仪器及试剂
4℃冰箱、恒温恒湿箱、通风橱、移液器、避光孵育湿盒。
试剂名称 | 1*TBS/L | 试剂名称 | 1*TBST/L |
Tris | 1.21g | 1*TBS | 1L |
NaCl | 8.8g | Tween 20 溶液 | 0.001L |
用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值 | 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值 |
二、实验步骤
一、实验仪器及试剂
微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、移液器、避光孵育湿盒、抗原修复盒。
试剂名称 | 1*TBS/L | 试剂名称 | 1*TBST/L |
Tris | 1.21g | 1*TBS | 1L |
NaCl | 8.8g | Tween 20 溶液 | 0.001L |
用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值 | 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值 |
二、实验步骤
This gene encodes a multifunctional protein that binds ubiquitin and regulates activation of the nuclear factor kappa-B (NF-kB) signaling pathway. The protein functions as a scaffolding/adaptor protein in concert with TNF receptor-associated factor 6 to mediate activation of NF-kB in response to upstream signals. Alternatively spliced transcript variants encoding either the same or different isoforms have been identified for this gene. Mutations in this gene result in sporadic and familial Paget disease of bone.
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