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重组兔单抗

SQSTM1/p62 Rabbit mAb (A19700)

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Western blot analysis of various lysates using SQSTM1/p62 Rabbit mAb (A19700) at 1:1000 dilution.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25μg per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 1s.

Western blot analysis of lysates from PC-12 cells, using SQSTM1/p62 Rabbit mAb (A19700) at 1:1000 dilution.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25μg per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 30s.

Western blot analysis of lysates from HeLa cells, using SQSTM1/p62 Rabbit mAb (A19700) at 1:1000 dilution.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25μg per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 180s.

Immunohistochemistry analysis of SQSTM1/p62 in paraffin-embedded human colon carcinoma tissue using SQSTM1/p62 Rabbit mAb (A19700) at a dilution of  1:1000 (40x lens). High pressure antigen retrieval was performed with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) prior to IHC staining.

Immunohistochemistry analysis of SQSTM1/p62 in paraffin-embedded Human lung adenocarcinoma tissue using SQSTM1/p62 Rabbit mAb (A19700) at a dilution of  1:1000 (40x lens). High pressure antigen retrieval was performed with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) prior to IHC staining.

Immunohistochemistry analysis of SQSTM1/p62 in paraffin-embedded human liver cancer tissue using SQSTM1/p62 Rabbit mAb (A19700) at a dilution of  1:1000 (40x lens). High pressure antigen retrieval was performed with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) prior to IHC staining.

Immunohistochemistry analysis of SQSTM1/p62 in paraffin-embedded human cervix cancer tissue using SQSTM1/p62 Rabbit mAb (A19700) at a dilution of  1:1000 (40x lens). High pressure antigen retrieval was performed with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) prior to IHC staining.

Immunohistochemistry analysis of SQSTM1/p62 in paraffin-embedded human small intestine tissue using SQSTM1/p62 Rabbit mAb (A19700) at a dilution of  1:1000 (40x lens). High pressure antigen retrieval was performed with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) prior to IHC staining.

Confocal imaging of HeLa cells using SQSTM1/p62 Rabbit mAb (A19700, dilution 1:200) (Red). The cells were counterstained with Alpha-tubulin (ubiquitous) chain Rabbit mAb (AC049, dilution 1:100) (Green). DAPI was used for nuclear staining (Blue). Objective: 60x.

Immunoprecipitation analysis of 300 μg extracts from HeLa cells using 3 μg SQSTM1/p62 Rabbit mAb (A19700). Western blot was performed from the immunoprecipitate using [KO Validated] SQSTM1/p62 Rabbit mAb (A19700) at a dilition of 1:1000.

All(10)|
货号: A19700
促销价：   ￥1310
货    期：现货产品
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文献引用 (56)

折叠内容

Publishing research using A19700? Please let us know so that we can cite the reference in this datasheet.

客户数据及评论 (1)

折叠内容
CustomerAug 092022
评分
Experiment Type
WB
Sample
HeLa、PC-3、U2-OS、293T
Description
Western blot analysis of human cells using [KO Validated] SQSTM1/p62 Rabbit mAb (A19700) at 1:500 dilution. The band observed at 62KDa.

详细信息

推荐稀释比
  • WB1:500 - 1:1000
  • IHC-P1:50 - 1:200
  • IF/ICC1:50 - 1:200
  • IP1:500 - 1:1000
浓度查询

请输入产品标签上的lot号，例如4000000001

反应物种
Human, Mouse, Rat
同种型
IgG
理论分子量
48kDa
实际分子量
62kDa
克隆号
ARC0180
产品形式
Liquid
偶联物
Unconjugated
存储缓冲液
Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.
Buffer: PBS with 0.02% sodium azide,0.05% BSA,50% glycerol,pH7.3.
阳性样本
293T,HeLa,L929,C2C12,PC-12
细胞定位
Cytoplasm,Cytoplasmic vesicle,Endoplasmic reticulum,Late endosome,Lysosome,Nucleus,P-body,autophagosome
纯化方式
Affinity purification

抗原信息

免疫原
A synthetic peptide corresponding to a sequence within amino acids 341-440 of human SQSTM1/p62 (Q13501).
序列
LSSKEVDPSTGELQSLQMPESEGPSSLDPSQEGPTGLKEAALYPHLPPEADPRLIESLSQMLSMGFSDEGGWLTRLLQTKNYDIGAALDTIQYSKHPPPL
进行序列比对

用户验证的应用

应用及物种
  • WB (Homo sapiens , Mus musculus , Gallus gallus , Rattus norvegicus , Sus scrofa , Human)
  • IHC (Mus musculus)
  • IF (Sus scrofa , Mus musculus , Homo sapiens)
  • IP (Mus musculus)

背景信息

This gene encodes a multifunctional protein that binds ubiquitin and regulates activation of the nuclear factor kappa-B (NF-kB) signaling pathway. The protein functions as a scaffolding/adaptor protein in concert with TNF receptor-associated factor 6 to mediate activation of NF-kB in response to upstream signals. Alternatively spliced transcript variants encoding either the same or different isoforms have been identified for this gene. Mutations in this gene result in sporadic and familial Paget disease of bone.

RRID
AB_2862742
基因ID
8878
Swiss Prot
Q13501
别名
p60; p62; A170; DMRV; OSIL; PDB3; ZIP3; p62B; NADGP; FTDALS3; SQSTM1/p62
研究领域

关联靶点

以SQSTM1为关键词搜索文献记录，得到上述基因与SQSTM1的研究紧密相关，排序顺序根据研究相关程度由高到低决定。（所显示数字代表两者共同出现的已发表文献数量）
◀1/▶

关联领域

以SQSTM1为关键词搜索文献记录，得到上述相关热词信息，可反映出SQSTM1的研究趋势与热点。（关联领域与基因名称的距离代表其研究热度）

* 该数据来源于赛特新思(citexs.com)
来自于发表文献，仅供参考所用，ABclonal不承担任何责任。

暂无以SQSTM1为关键词搜索的文献记录。

该服务由赛特新思提供，上述关联分析来自已发表文献，仅供参考所用，ABclonal不承担任何责任。

FAQ

折叠内容

ABclonal公司的抗体，可以回收利用几次？

首先，一般抗体不推荐客户回收利用，抗体使用之后缓冲体系已经发生改变，不同客户在回收抗体的保存条件上也会有差异，所以抗体回收使用效果无法保证。另外，ABclonal公司也做过一批抗体回收验证测试，测试结果显示不同抗体可回收次数不同，一般效价越高的抗体，可重复使用的次数越多，客户可根据实验情况来确定。
注：我们将孵育完毕后剩余的抗体回收到离心管中置于4℃保存，效价高的抗体可至少保存1周，至少重复利用3次。

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ABclonal作为国产抗体品牌的优势？

武汉爱博泰克生物（ABclonal）科技有限公司是国产品牌，她成立于2011年，公司依托ABclonal美国波士顿抗体与蛋白研发中心、中国光谷生物城(武汉)抗体生产基地以及上海张江分子酶研发中心，凝聚了十余位来自哈佛大学、麻省理工、复旦大学、上海交大、中科院生化细胞所和武汉大学的全球知名分子和免疫学方面博士，组成我们的科学家团队，通过聚焦抗体与酶核心技术，致力于打破国际技术的垄断，将公司打造成为科研工具和诊断原料的国内领导品牌，乃至弯道超越国际巨头。 我们拥有包括兔多克隆抗体、小鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体的生产研发平台，同时也有包括WB,IHC,IF,IP,CHIP在内的检测平台，我们对每一支自产的抗体进行了严格的检测。当然，我们部分直销地区也可以帮客户代购进口品牌的产品。同时也有抗体定制服务。ABclonal抗体优势：1，严自检，保质量；2产品多，指标全；3，价格低，货期短。注：ABclonal抗体价格体系详情见附件

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ABclonal抗体成分？

ABclonal抗体成分在平时工作当中，常会有客户咨询我们的抗体用的什么buffer进行保存，一般来说，我们的buffer的成分是：PBS含0.03%的proclin300、0.05%牛血清白蛋白、50%甘油；也有一些是PBS含0.03%的proclin300，50%甘油。防腐剂 Proclin 300活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MCI）和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMCI）。ProClin生物灭活剂能够迅速穿透细胞膜，抑制对细胞呼吸至关重要的特定酶，因此一接触微生物有机体就会立即抑制细胞活性。ProClin的多个特定毒性位点可以防止微生物产生高水平的耐药性。

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实验方案

折叠内容
WB

蛋白质印迹法标准操作流程

一、实验试剂及耗材

1、样品制备试剂
  • a. RIPA 裂解液
  • b. 蛋白酶抑制剂
  • c. BCA工作液
  • d. BSA Standard Solution(5mg/ml)（RM00005）
  • e. 1×PBS缓冲液（RM00012）
  • f. 5×loading buffer（RM00001）
2、制胶试剂
  • a．30% Acr-Bis (29:1)（RM00006）
  • b．1 M Tris-HCl (pH6.8)（RM00003）
  • C．1.5M Tris-HCl (pH8.8)（RM00002）
  • d．10%SDS（RM00004）
  • e．10%Ammonium persulfate (APS)（RM00007）
  • f．TEMED（RM00009）
3、电泳、转膜试剂及耗材
  • a. 1X Tris-Glycine SDS Running Buffer（RM00010）
  • b. 1X Western Transfer Buffer（RM00011）
  • c. Filter Paper (7.5×10cm)（RM00019）
  • d. Nitrocellulose membrane（RM00017/ RM02801/ RM00018）
4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂
  • a. 1XTBST Buffer（RM00013）
  • b. 1X Western Blocking Buffer（RK05742）
  • c. Skimmed milk powder（RM00014）
  • d. Bovine Serum Albumin (BSA)（RM02802）
  • e. Western Antibody Dilution Buffer（RK05743）
  • f. HRP 偶联二抗（AS014/AS003）
  • g. SignalFire™ ECL Reagent（RM00020/RM00021）

二、实验步骤

1、样品制备

（1）细胞收集

  • a. 贴壁培养细胞收集
    去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养基清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
  • b. 悬浮培养细胞收集
    速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。手指轻弹细胞，使其松散。
  • c. 组织样本收集
    把组织剪切成细小的碎片，越小越好。取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。

（2）总蛋白提取

  • a. 细胞/组织裂解
    将装有细胞沉淀或组织碎片的容器完全插入冰中。细胞沉淀按照1mL裂解液/107个细胞(1个T75培养瓶细胞量)的比例加入相应体积的裂解液（细胞量足够时都加入3mL，不足时根据细胞量计算），裂解20min，每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s。组织碎片按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重复5次，使组织尽量碾碎。（裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂）。
  • b. 离心
    把裂解好的样品配平后，置于预冷的高速冷冻离心机中，12000 rpm，15min。
  • c. 蛋白变性
    完成离心后，上清即为蛋白提取液。吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入1/5上清体积的5×Loading Buffer（最终工作液为1X），待干式恒温器温度升至95℃后，将1.5mL离心管插入加热孔中，95℃加热变性10min，待液体完全冷却后置于-20℃保存。

（3）蛋白浓度测定（BCA法）

  • a. BCA工作液的配置
    根据样品数量，按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B（50:1）配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。
  • b. 标准品测定
    取10μl蛋白标准品（5mg/ml BSA）稀释至50μl，使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1*PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中，加稀释液补足到20μl（见附表）。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，如果样本不足20μl，需加稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
2、凝胶电泳

（1）制胶器安装

  • 根据使用说明书安装。

（2）分离胶制备

  • 根据不同蛋白大小，选择不同浓度的分离胶（见附件表）。将制备好的胶溶液注入预先安装好的制胶器中，加入异丙醇封胶。室温水平放置30min左右。注意防止胶溶液产生气泡并注入制胶器中；注胶前再加入TEMED，防止注胶前凝固；注入异丙醇时需沿玻板一边缓慢拖动加入。

（3）浓缩胶制备

  • 分离胶凝固后，沿玻板一边倒出异丙醇，并用滤纸吸干。再根据需要的体积制备浓缩胶（见附表）。将制备好的胶溶液注入制胶器中，并把准备好的样品梳沿玻板一端缓慢插入胶溶液中，室温水平放置20-30min。注意样品梳与胶溶液之间避免气泡产生。

（4）上样

  • 待浓缩胶凝固好后，双手垂直拔出样品梳，并用Tris-Glycine SDS Running Buffer注入到内外槽中，形成闭合回路。用移液器吸取样品垂直梳孔上样，蛋白含量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm即可。

（5）电泳

  • 上样完以后，连通电泳仪电源，注意正负极需连接正确，设定适宜的电泳参数，浓缩胶电泳参数为恒压80V，待样本进入分离胶是，可将电泳调至120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时，停止电泳，关闭电泳仪电源，或根据目的蛋白分子量大小参照Marker电泳情况延长电泳时间。
3、转膜

（1）准备工作

  • a. Western Transfer Buffer至少提前2h （即开始电泳后）放入-20℃冰箱预冷，但注意避免结冰。
  • b. 根据胶体大小,将Filter Paper及Nitrocellulose membrane剪裁至合适尺寸。
  • c. 目的蛋白＞20KD选择0.45μm NC膜/PVDF膜；目的蛋白＜20KD选择0.2μmNC膜或PVDF膜，选择完毕后将NC膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用，注意如使用的是PVDF膜需先放入甲醇中浸泡5-10min，再放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

（2）转膜

  • 取出玻板中的凝胶，在夹板上依次放一块多孔垫、三张滤纸、凝胶、膜、三张滤纸、一块多孔垫（“三明治”结构），将转好的膜放在转膜槽，按一定的条件进行转膜。（见附表）
4、封闭
  • 将膜从“三明治”结构中取出，放入合适的抗体孵育槽中，加入Western Blocking Buffer室温孵育1h，一张6.3×8.3cm大小的膜加入6~7ml即可。
5、一抗孵育
  • a. 将一抗用1X Western Blocking Buffer/1XTBST Buffer按照合适比例进行稀释。
  • b. 封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中，室温2h或4℃过夜。
6、洗涤
  • 一抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。
7、二抗孵育
  • a. 一抗洗涤结束前10min，将二抗用1XTBST Buffer按照合适比例进行稀释。
  • b. 洗涤结束后，将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中，室温1h。
8、洗涤
  • 二抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。
9、曝光
  • a. 根据膜的大小，按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液，按比例吸取等体积的 SolutionⅠ和 SolutionⅡ混匀，配制成发光检测工作液。
  • b. 用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上，使其均匀覆盖，室温孵育 1-2min，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
  • c. 压片检测：将膜固定于片夹内。暗室内压片 1 分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30s、60s、90s、180s，然后一起显影定影观察结果。
  • d. 荧光成像仪检测：将膜放置到荧光成像仪内，参考仪器说明书进行检测。

附表1：BSA标准品稀释

1mg/ml BSA(μl) 稀释液(μl) 对应的蛋白含量（mg/ml）
0 20 0
1 19 0.05
2 18 0.1
4 16 0.2
8 12 0.4
12 8 0.6
16 4 0.8
20 0 1

附表2：分离胶浓度的选择

分子量（kDa) 分离胶浓度
X≤10 15%
10<X≤15 13.5%
15<X≤25 12%
25<X≤35 11%
35<X≤40 10%
40<X≤55 9%
55<X≤70 8%
70<X≤100 7%
100<X 6%
备注：X为目的蛋白大小

附表3：分离胶配制

分离胶浓度 6% 7% 8% 9% 10% 11% 12% 13.5% 15%
去离子水（mL） 5.3 4.9 4.6 4.3 4.0 3.65 3.3 2.8 2.3
30%丙烯酰胺 （mL） 2 2.4 2.7 3.0 3.3 3.65 4.0 4.5 5.0
1.5M Tris-HCL(pH8.8) （mL） 2.5
10%SDS（mL） 0.1
10%AP（mL） 0.1
TEMED（mL） 0.01
总体积（mL） 10

附表4：浓缩胶配制

5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶
去离子水（mL） 1.1 2.1 2.7 3.4 4.1
30%丙烯酰胺 （mL） 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0
1.0M Tris-HCL(pH6.8) （mL） 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75
10%SDS（mL） 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
10%AP（mL） 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
TEMED（mL） 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006
总体积（mL） 2 3 4 5 6

附表5：转膜条件选择

分子量（kDa) 转膜条件
X≤10 恒流200mA,30min
10 < X≤15 恒流200mA,40min
15< X≤20 恒流200mA,50min
20< X≤50 恒流200mA, 1kDa/min+20min
50< X≤100 恒流200mA, 1kDa/min+30min
100< X≤150 恒流250mA, 1kDa/min+20min
150< X≤180 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在3h内)
180< X 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在4h内)
备注：X为目的蛋白大小
展开
IHC-P

免疫组织化学标准操作流程（石蜡切片——非磷酸化项目检测）

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、光学显微镜、移液器、孵育湿盒、抗原修复盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液：0.01M PBS pH7.2±0.2; 0.01M pH7.2 PBST;
    试剂名称 1*PBS/L 试剂名称 1*PBST/L
    NaH2PO4 0.23g 1*PBS溶液 1L
    Na2HPO4 1.15g Tween 20 溶液 0.001L
    NaCl 8.5g 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
  • (2) 修复液（可选）：
    pH6.0 0.01M柠檬酸修复液（1L）：C6H8O7•H2O 0.4g；NaC6H5O7•2H2O 3g；pH6.0；
    pH7.0 0.01M PBS修复液（1L）：KH2PO4 0.07g；NaCl 7.89g；Na2HPO4 0.45g；KCl 0.10g；pH7.2-7.4；
    pH8.0 0.05M Tris-EDTA修复液（1L）：C4H11NO3 6.05g；C10H14N2Na2O8•2H2O 0.29g；用稀HCl调至pH8.0；
    pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液（1L）：C4H11NO3 1.21g；C10H14N2Na2O8•2H2O 0.37g；pH9.0。
  • (3) 封闭液：5%空白山羊血清;
  • (4) 3%过氧化氢（需新鲜配制，30% H2O2与dH2O体积比1:9）;
  • (5) 抗体稀释液：1X PBS + 5% 正常血清 + 0.3% Triton™ X-100;
  • (6) EnVision Systems检测体系, HRP显色系统： HRP RABBIT/MOUSE及配套DAB显色液;
  • (7) 脱蜡液、无水乙醇（分析纯）、去离子水（dH2O）、Mayer’s苏木素、中性树胶封片剂。

二、实验步骤

1．水化/脱蜡：
  • （1）烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；
  • （2）脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟。
注意：流水清洗时水流不能直接对着切片；操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
2．内源性过氧化物酶灭活：
  • 将切片完全浸入到3%双氧水溶液中，室温，孵育10分钟；完成后流水清洗5分钟。
注意：内源性酶含量高的组织，可以延长灭活时间至15-20分钟；双氧水需新鲜配制，可提前5-10分钟配制3%的双氧水。
3．抗原修复（可选）：
  • （1）方法一，微波热修复：将切片浸入盛有修复液的修复盒中，将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上；整体放入微波炉中，高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；再高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；随后中低火加热1分钟后停火，微波炉内静置5分钟，然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。待修复液温度降至室温后，用缓冲液PBS洗涤3次，每次1min。
  • （2）方法二，高压热修复：在高压锅中，加入抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时2分钟；计时结束后离开热源，自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后，用缓冲液PBS洗涤3次，每次1min。
注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；修复完成后避免快速冷却；修复液可根据实验需求自行选用修复液。
4．染色：
  • （1）封闭：待修复液温度降至室温后，从修复盒中取出切片；用缓冲液PBS清洗切片2次，每次3分钟；去除切片上的缓冲液；在组织切片上滴加5%空白山羊血清封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于37℃恒温孵育30分钟；
  • （2）一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用缓冲液PBS稀释的一抗，水平放置于孵育湿盒中，于4℃孵育过夜；
  • （3）复温：将孵育湿盒取出室温复温15-30分钟，去除抗体工作液，用缓冲液PBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液PBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （4）二抗孵育：在组织切片上滴加二抗工作液后水平放置于孵育湿盒中，于37℃恒温孵育1h；
  • （5）去除切片上的溶液，用缓冲液PBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液PBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （6）显色：显色前5分钟，配置DAB显色工作液，C液:B液体积比1:100，充分混匀；在组织切片上滴加显色工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，通常10-60秒即可得到合适的染色强度；将切片浸入大量dH2O中即可终止显色；
  • （7）复染、返蓝：将切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片，用流水清洗10分钟。
注意：染色过程中需一直保持切片处于湿润状态；染色过程中所有试剂使用过程中均需保证完全覆盖切片上组织。
5．脱水、封片：
  • （1）脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，10秒；高温（55℃-60℃）下完全干燥；
  • （2）封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片。
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IF/ICC

免疫荧光实验操作流程（细胞样本）

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

4℃冰箱、恒温恒湿箱、通风橱、移液器、避光孵育湿盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液：0.01M pH7.2±0.2 TBS ；0.01M pH7.2±0.2 TBST
    试剂名称 1*TBS/L 试剂名称 1*TBST/L
    Tris 1.21g 1*TBS 1L
    NaCl 8.8g Tween 20 溶液 0.001L
    用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
  • (2) 固定液：4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制）
  • (3) 抗体稀释液：1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
  • (4) 通透剂：0.3% Triton X-100（TBS缓冲液配制）
  • (5) 二抗（可选）：
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074；
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073；
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077；
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076；
  • (6) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制）
  • (7) 去离子水（dH2O）、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1．样本前处理
  • (1) 弃去培养基，在细胞上缓慢加入常温TBS，清洗2次，每次5秒；
  • (2) 细胞固定：在细胞上覆盖 4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制），置于4℃，固定15min；固定液需足量；
  • (3) 固定液的清洗：去除固定液，使用4℃预冷的TBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟；
注意：需避免实验操作时温差过大或温度骤变；固定液需保证足量，可过量使用；甲醛有毒性，加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作。
2．染色步骤
  • （1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
  • （2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于4℃孵育过夜；
  • （3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2±0.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：TBS缓冲液体积比1:500，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （6）细胞孔板可直接加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞涂片滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞爬片可取出，盖在滴加抗荧光衰减封片剂的载玻片上后，于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意：实验中，所有试剂滴加应准确、快速、足量，不能出现干片的情况；染色步骤从二抗孵育开始，后续所有步骤都需注意避光操作；染色完成后需及时观察并采集图像，避免干燥和荧光物质淬灭。

免疫荧光实验操作流程（石蜡切片）

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、移液器、避光孵育湿盒、抗原修复盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液：0.01M pH7.2±0.2 TBS ；0.01M pH7.2±0.2 TBST
    试剂名称 1*TBS/L 试剂名称 1*TBST/L
    Tris 1.21g 1*TBS 1L
    NaCl 8.8g Tween 20 溶液 0.001L
    用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
  • (2) 修复液（可选）：
    pH6.0 0.01M柠檬酸修复液（1L）：C6H8O7•H2O 0.4g；NaC6H5O7•2H2O 3g；pH6.0；
    pH7.0 0.01M PBS修复液（1L）：KH2PO4 0.07g；NaCl 7.89g；Na2HPO4 0.45g；KCl 0.10g；pH7.2-7.4；
    pH8.0 0.05M Tris-EDTA修复液（1L）：C4H11NO3 6.05g；C10H14N2Na2O8•2H2O 0.29g；用稀HCl调至pH8.0；
    pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液（1L）：C4H11NO3 1.21g；C10H14N2Na2O8•2H2O 0.37g；pH9.0。
  • (3) 封闭液：5%空白山羊血清
  • (4) 抗体稀释液：1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
  • (5) 二抗：
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074；
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073；
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077；
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076；
  • (6) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2±0.2 TBS配制）
  • (7) 去离子水（dH2O）、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1．水化/脱蜡：
  • (1) 烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；
  • (2) 脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟。
注意：流水清洗时水流不能直接对着切片；操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
2．抗原修复：
  • （1）方法一，微波热修复：将切片浸入盛有修复液的修复盒中，将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上；整体放入微波炉中，高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；再高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；随后中低火加热1分钟后停火，微波炉内静置5分钟，然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。
    注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开微波炉门；修复完成后不可快速冷却；修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
  • （2）方法二，高压热修复：在高压锅中，加入抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时2分钟；计时结束后离开热源，自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后，用缓冲液洗涤3次，每次1min。
    注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
3．染色：
  • （1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
  • （2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于4℃孵育过夜；
  • （3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：0.01M pH7.2 TBS缓冲液体积比1:500，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （6）滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意：实验中，所有试剂滴加应准确、快速、足量，不能出现干片的情况；染色步骤从二抗孵育开始，后续所有步骤都需注意避光操作；染色完成后需及时观察并采集图像，避免干燥和荧光物质淬灭。
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IP

IP检测

一、实验试剂

  • （1）rProtein A/G Plus MagPoly Beads（RM09008）
  • （2）裂解液&洗杂液：Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)（RM00022）
  • （3）蛋白酶抑制剂
  • （4）封闭液：含 3% BSA 的 1X PBS
  • （5）1×PBS 缓冲液(RM00012)
  • （6）5×loding buffer（RM00001）（使用时用去离子水稀释至工作浓度即可）
  • （7）Control IgG （AC005/ AC011/AC034）

二、实验步骤

1、样本处理

（1）贴壁培养细胞

  • a. 取裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
  • b. 去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养基清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
  • c. 按照6孔板每孔加入100~200μl裂解液的比例，加入裂解液。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液作用于细胞1~5s内，细胞会被裂解。
  • d. 1000~12000g，离心3~5min（如果用冷冻离心机4℃效果更佳），取上清。

（2）悬浮培养细胞

  • a. 取裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
  • b. 速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
  • c. 手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔加入100~200μl裂解液的比例，加入NP-40裂解液。通常6孔板每孔加入100~200μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量150~200μl，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应无明显沉淀。
  • d. 1000~12000g，离心3~5min（如果用冷冻离心机4℃效果更佳），取上清。

（3）组织样本

  • a. 取裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
  • b. 把组织剪切成细小的碎片，越小越好。
  • c. 取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。
  • d. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30-60min。（步骤3、4也可采用以下过程：按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例加入NP-40裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。）
  • e. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例，加入裂解液。
  • f. 1000~12000g，4℃离心10~15min（如无低温离心机，室温下离心也可），取上清。
2、磁珠预处理
  • （1）将rProtein A/G Plus MaqPoly Beads颠倒或漩涡混匀，翻转瓶身发现底部无黑色沉淀即可。
  • （2）取30μl rProtein A/G Plus MaqPoly Beads至新的EP管中，放在磁分离器上，待溶液澄清后，用移液器吸弃保护液。
  • （3）将EP管从磁分离器上取下来，加入1ml Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)，混匀，放置在磁分离器上，收集磁珠，用移液器吸弃洗杂液，重复2次。
  • （4）将EP管从磁分离器上取下来，加入1mL的3% BSA，置于翻转混合仪4℃封闭1h.
  • （5）重复步骤3），备用。
3、磁珠、抗原-抗体复合物结合
  • （1）将含有抗原的样品（通常300μl-1000μl，总蛋白量200μg）中加入目标抗体（通常3μg），置于翻转混合仪4℃下反应2h或过夜。
  • （2）将上述完成抗体-抗原结合的复合物与备用好的磁珠进行混合，置于4℃下反应2h或过夜。
  • （3）将上述磁珠-抗体-抗原复合物放在磁分离器上进行分离，收集上清液，以备后续检测。
  • （4）向离心管中加入1ml洗杂液，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液；从磁分离器上取下离心管，重复洗涤两次。
4、抗原洗脱

（1）变性洗脱(此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。)

  • a. 从磁分离器上取下离心管，向其中加入30μl 2X SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，95℃加热15min。
  • b. 置于磁性分离器上进行磁性分离，收集上清液进行SDS-PAGE检测。

（2）非变性洗脱

  • a. 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入50μl洗脱液，混合均匀，室温孵育5min。
  • b. 置于磁性分离器上进行磁性分离，收集洗脱液至新的EP管中。
  • c. 重复步骤1）和2），收集洗脱液，与2）中洗脱液混合，加入中和液中和至pH7.0-8.0。用于后期功能分析。
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