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Immunoprecipitation analysis of 200 μg extracts of U-251MG cells using 3 μg p53 antibody (A5761). Western blot was performed from the immunoprecipitate using p53 antibody (A5761) at a dilution of 1:1000.

Immunoprecipitation analysis of 200 μg extracts of U-251MG cells using 3 μg p53 antibody (A5761). Western blot was performed from the immunoprecipitate using p53 antibody (A5761) at a dilution of 1:1000.

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货号: A5761
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Publishing research using A5761? Please let us know so that we can cite the reference in this datasheet.

客户数据及评论 (3)

折叠内容
CustomerSep 282017
评分
Experiment Type
Western blot(WB)
Sample
Hepatoma cell line
Description
Western blot analysis of extracts of Hepatoma cell line, using Tp53 antibody (A5761) at 1:1000 dilution.The band is specific and clear.
CustomerDec 172015
评分
Experiment Type
Western blot(WB)
Sample
Rat cells
Description
Western blot analysis of extracts of rat cells
CustomerDec 142015
评分
Experiment Type
Western blot(WB)
Sample
MEF
Description
Western blot analysis of extracts of MEF cells, using TP53 Polyclonal Antibody.

详细信息

推荐稀释比
  • WB1:3000 - 1:6000
  • IP0.5μg-4μg antibody for 200μg-400μg extracts of whole cells
浓度查询

请输入产品标签上的lot号,例如4000000001

反应物种
Human
同种型
IgG
理论分子量
44kDa
实际分子量
53kDa
产品形式
Liquid
偶联物
Unconjugated
存储缓冲液
Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.
Buffer: PBS with 0.01% thimerosal,50% glycerol,pH7.3.
阳性样本
U-251MG
细胞定位
Cytoplasm,Endoplasmic reticulum,Mitochondrion matrix,Nucleus,PML body
纯化方式
Affinity purification

抗原信息

免疫原
A synthetic peptide corresponding to a sequence within amino acids 218-390 of human p53 (NP_035770.2).
序列
EPPEAGSEYTTIHYKYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRDSFEVRVCACPGRDRRTEEENFRKKEVLCPELPPGSAKRALPTCTSASPPQKKKPLDGEYFTLKIRGRKRFEMFRELNEALELKDAHATEESGDSRAHSSYLKTKKGQSTSRHKKTMVKKVGPDSD

用户验证的应用

应用及物种
  • WB (Hepatoma cell line , Rat cells , MEFHomo sapiens , Mus musculus , Mus musculus , Homo sapiens , Homo sapiens , Lampetra japonica , Sus scrofa , Rattus norvegicus , ovis aries)
  • IF (Mus musculus , Lampetra japonica)
  • IHC (Homo sapiens)

背景信息

This gene encodes a tumor suppressor protein containing transcriptional activation, DNA binding, and oligomerization domains. The encoded protein responds to diverse cellular stresses to regulate expression of target genes, thereby inducing cell cycle arrest, apoptosis, senescence, DNA repair, or changes in metabolism. Mutations in this gene are associated with a variety of human cancers, including hereditary cancers such as Li-Fraumeni syndrome. Alternative splicing of this gene and the use of alternate promoters result in multiple transcript variants and isoforms. Additional isoforms have also been shown to result from the use of alternate translation initiation codons from identical transcript variants (PMIDs: 12032546, 20937277).

基因ID
Swiss Prot
别名
P53; BCC7; LFS1; BMFS5; TRP53; p53

关联靶点

TP53为关键词搜索文献记录,得到上述基因与TP53的研究紧密相关,排序顺序根据研究相关程度由高到低决定。(所显示数字代表两者共同出现的已发表文献数量)
1/

关联领域

TP53为关键词搜索文献记录,得到上述相关热词信息,可反映出TP53的研究趋势与热点。(关联领域与基因名称的距离代表其研究热度)

* 该数据来源于赛特新思(citexs.com)
来自于发表文献,仅供参考所用,ABclonal不承担任何责任。

暂无以TP53为关键词搜索的文献记录。

该服务由赛特新思提供,上述关联分析来自已发表文献,仅供参考所用,ABclonal不承担任何责任。

ABclonal公司的抗体,可以回收利用几次?

首先,一般抗体不推荐客户回收利用,抗体使用之后缓冲体系已经发生改变,不同客户在回收抗体的保存条件上也会有差异,所以抗体回收使用效果无法保证。另外,ABclonal公司也做过一批抗体回收验证测试,测试结果显示不同抗体可回收次数不同,一般效价越高的抗体,可重复使用的次数越多,客户可根据实验情况来确定。
注:我们将孵育完毕后剩余的抗体回收到离心管中置于4℃保存,效价高的抗体可至少保存1周,至少重复利用3次。

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ABclonal作为国产抗体品牌的优势?

武汉爱博泰克生物(ABclonal)科技有限公司是国产品牌,她成立于2011年,公司依托ABclonal美国波士顿抗体与蛋白研发中心、中国光谷生物城(武汉)抗体生产基地以及上海张江分子酶研发中心,凝聚了十余位来自哈佛大学、麻省理工、复旦大学、上海交大、中科院生化细胞所和武汉大学的全球知名分子和免疫学方面博士,组成我们的科学家团队,通过聚焦抗体与酶核心技术,致力于打破国际技术的垄断,将公司打造成为科研工具和诊断原料的国内领导品牌,乃至弯道超越国际巨头。 我们拥有包括兔多克隆抗体、小鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体的生产研发平台,同时也有包括WB,IHC,IF,IP,CHIP在内的检测平台,我们对每一支自产的抗体进行了严格的检测。当然,我们部分直销地区也可以帮客户代购进口品牌的产品。同时也有抗体定制服务。ABclonal抗体优势:1,严自检,保质量;2产品多,指标全;3,价格低,货期短。注:ABclonal抗体价格体系详情见附件

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ABclonal抗体成分?

ABclonal抗体成分在平时工作当中,常会有客户咨询我们的抗体用的什么buffer进行保存,一般来说,我们的buffer的成分是:PBS含0.03%的proclin300、0.05%牛血清白蛋白、50%甘油;也有一些是PBS含0.03%的proclin300,50%甘油。防腐剂 Proclin 300活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)。ProClin生物灭活剂能够迅速穿透细胞膜,抑制对细胞呼吸至关重要的特定酶,因此一接触微生物有机体就会立即抑制细胞活性。ProClin的多个特定毒性位点可以防止微生物产生高水平的耐药性。

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实验方案

折叠内容
WB

蛋白免疫印迹实验步骤

一、实验仪器及试剂

1、样品制备试剂
  • a. RIPA 裂解液
  • b. 蛋白酶抑制剂
  • c. BCA工作液
  • d. BSA Standard Solution(5mg/ml)(RM00005)
  • e. 1×PBS缓冲液(RM00012)
  • f. 5×loading buffer(RM00001)
2、制胶试剂
  • a.30% Acr-Bis (29:1)(RM00006)
  • b.1 M Tris-HCl (pH6.8)(RM00003)
  • C.1.5M Tris-HCl (pH8.8)(RM00002)
  • d.10% SDS(RM00004)
  • e.10% Ammonium persulfate (APS)(RM00007)
  • f.TEMED(RM00009)
3、电泳、转膜试剂及耗材
  • a. 1X Tris-Glycine SDS Running Buffer(RM00010)
  • b. 1X Western Transfer Buffer(RM00011)
  • c. Filter Paper (7.5×10cm)(RM00019)
  • d. Nitrocellulose membrane(RM00017/ RM02801/ RM00018)
4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂
  • a. 1XTBST Buffer(RM00013)
  • b. 1X Western Blocking Buffer(RK05742)
  • c. Skimmed milk powder(RM00014)
  • d. Bovine Serum Albumin (BSA)(RM02802)
  • e. Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)
  • f. HRP 偶联二抗(根据一抗情况选用,AS014/AS003等可供选择)
  • g. SignalFire™ ECL Reagent(RM00020/RM00021)

二、实验步骤

1、样品制备

(1)细胞收集

  • a. 贴壁培养细胞收集
    用细胞刮刮下细胞或用胰酶消化处理后,400×g,离心5 min,弃上清;用适量冰PBS溶液将离心后细胞沉淀重悬,4℃,400×g 离心5min,弃上清,重复清洗步骤一次收集细胞沉淀。
  • b. 悬浮培养细胞收集
    收集悬浮细胞,400×g离心5min,弃上清,适量冰PBS溶液将离心后细胞沉淀重悬,4℃,400×g 离心5min,弃上清,重复清洗步骤一次,收集细胞沉淀。
  • c. 组织样本收集
    把组织在预冷的表面上剪切成细小碎块,然后用液氮或超低温冰箱中冷冻组织30min以上,迅速加液氮研磨,研磨过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。

(2)总蛋白提取

  • a. 细胞/组织裂解:
    根据收集的细胞数量、细胞种类添加适量的裂解液。
    例如常规细胞沉淀可按照1mL裂解液/107个细胞的比例加入相应体积的裂解液,加入裂解液后将沉淀吹打混匀。使用细胞破碎仪超声样本,每次超声时间4-5s,间隔时间在5s左右,肉眼观察,样本为均一,不粘稠液体即可。或采用震荡裂解方式进行,每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s,裂解20min。
    组织碎片可按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液,每3min研磨一次,重复5次,使组织尽量碾碎(裂解液中根据需要添加或不添加蛋白酶抑制剂)。所有理解过程,务必在低温条件下进行。
  • b. 离心:
    把裂解好的样品配平后,将裂解好的样本置于预冷的高速冷冻离心机中,13000×g离心10min,收集上清
  • c. 蛋白变性:
    吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入对应体积的5× Loading Buffer(最终工作液为1×),待干式恒温器温度升至95℃后,将1.5mL离心管插入加热孔中,95℃加热变性10min,待液体完全冷却后置于-20℃保存。

(3)蛋白浓度测定(BCA法)

  • a. BCA工作液的配置
    根据样品数量,按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B(50:1)配置适量BCA工作液,充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。
  • b. BSA标准品梯度稀释
    取10μl蛋白标准品(5 mg/mL BSA)稀释至50μl,使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1×PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中,加稀释液补足到20μl。
  • c. 样本浓度测定
    加适当体积样品到96孔板的样品孔中,如果样本不足20μl,需加稀释液补足到20μl。每孔加入 200μl BCA工作液,37℃放置20-30min。用酶标仪测定样本和标准品在562nm下的吸光度,或在540-595nm之间波长下的吸光度。根据BSA蛋白浓度标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
2、凝胶电泳

(1)制胶器安装

  • 根据使用说明书安装。

(2)凝胶配置

  • 根据目标蛋白大小,选择不同合适浓度的分离胶(见附表)。注意该过程注意不能有气泡产生。

(3)上样

  • 待胶凝固好后,用移液器吸取样品垂直梳孔上样,建议总蛋白上样量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满,外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm即可。

(4)电泳

  • 上样完成后,连通电泳仪电源,注意正负极需连接正确,设定适宜的电泳参数。建议浓缩胶电泳参数为恒压80V,分离胶采用恒压120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时,停止电泳,关闭电泳仪电源。
3、转膜

(1)准备工作

  • a. 转膜缓冲液可提前2h (即开始电泳后)放入-20℃冰箱预冷。
  • b. 根据胶的面积大小,将滤纸以及NC膜剪裁至合适尺寸。
  • c. 建议目的蛋白大于20KD可选择0.45μm NC膜;目的蛋白小于20KD可选择0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜。选择完毕后将膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用。注意使用PVDF膜需先放入甲醇中浸泡1min左右至均匀浸透,没有白点即可放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

(2)转膜

  • 根据目的蛋白大小,选择合适的转膜条件(见附表)。
4、封闭
  • 转膜完成后,将膜取出,放入合适的抗体孵育槽中,加入Western Blocking Buffer 室温孵育1h,加入TBST Buffer洗涤3次,每次5 min。
5、抗体孵育

根据所使用的一抗种类,选择进行下述其中1项的具体步骤

(1)对于无偶联的一抗

  • a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗体说明书推荐比例进行稀释,室温孵育1.5h或4℃过夜孵育。
  • b. TBST Buffer洗涤4次,每次5 min。
  • c. 按一抗来源选取合适的HRP偶联二抗,按照合适比例进行稀释,室温孵育1h。
  • d. TBST Buffer洗涤4次,每次5 min。
  • e. 继续进行后续曝光操作。

(2)对于偶联有HRP的一抗

  • a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗体说明书推荐比例进行稀释,室温孵育1.5h或4℃过夜孵育。
  • b. 用TBST Buffer洗涤4次,每次5 min。
  • c. 继续进行后续曝光操作。
6、曝光
  • a. 吸取等体积ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ混匀,配制成发光检测工作液。推荐用量为每10cm2的膜使用1-2 mL发光检测工作液即可。
  • b. 用镊子将膜取出,膜的下缘轻轻接触吸水纸,去除膜上多余的液体。用移液枪吸取工作液并均匀覆盖转印膜,室温孵育 1-2 minutes,此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
  • c. 获取WB结果:
    1) 传统压片曝光显影:将膜固定于片夹内。暗室内压片1分钟,立即显影定影,根据结果再调整压片时间获取最佳信噪比图片。或直接分别压片 30 秒、1、3、5分钟,然后一起显影定影观察结果。
    2) 化学发光成像仪获取电子图片:将膜放置到成像仪内,参考仪器说明书设置合适的参数以获取优化图片。同时应根据靶蛋白的生物学性质如丰度等来调节成像参数。

附表1:BSA标准品稀释

1mg/ml BSA(μl) 稀释液(μl) 对应的蛋白含量(mg/ml)
0 20 0
1 19 0.05
2 18 0.1
4 16 0.2
8 12 0.4
12 8 0.6
16 4 0.8
20 0 1

附表2:分离胶浓度的选择

分子量(kDa) 分离胶浓度
X≤10 15%
10<X≤15 13.5%
15<X≤25 12%
25<X≤35 11%
35<X≤40 10%
40<X≤55 9%
55<X≤70 8%
70<X≤100 7%
100<X 6%
备注:X为目的蛋白大小

附表3:分离胶配制

分离胶浓度 6% 7% 8% 9% 10% 11% 12% 13.5% 15%
去离子水(mL) 5.3 4.9 4.6 4.3 4.0 3.65 3.3 2.8 2.3
30%丙烯酰胺 (mL) 2 2.4 2.7 3.0 3.3 3.65 4.0 4.5 5.0
1.5M Tris-HCL(pH8.8) (mL) 2.5
10%SDS(mL) 0.1
10%AP(mL) 0.1
TEMED(mL) 0.01
总体积(mL) 10

附表4:5%浓缩胶配方

5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶
去离子水(mL) 1.1 2.1 2.7 3.4 4.1
30%丙烯酰胺 (mL) 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0
1.0M Tris-HCL(pH6.8) (mL) 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75
10%SDS(mL) 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
10%AP(mL) 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
TEMED(mL) 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006
总体积(mL) 2 3 4 5 6

附表5:转膜条件选择

分子量(kDa) 建议转膜条件(湿转)
X≤10 恒流200mA,30min
10<X≤15 恒流200mA,40min
15<X≤20 恒流200mA,50min
20<X≤50 恒流200mA, 1kDa/min+20min
50<X≤100 恒流200mA, 1kDa/min+30min
100<X≤150 恒流250mA, 1kDa/min+20min
150<X≤180 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在3h内)
180<X 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在4h内)
备注:X为目的蛋白大小以上为建议转膜条件,可根据使用转移设备的转膜效率、目的分子量大小等综合选择合适的转膜条件。针对大分子量或极小分子量蛋白,尤其注意需合理调整转膜液、转膜条件、转膜温度等问题。
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IP

IP检测

一、实验试剂

  • (1)Protein A/G Magnetic beads
  • (2)裂解液&洗杂液:Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)(RM00022)
  • (3)蛋白酶抑制剂(RM02916)
  • (4)封闭液:含 3 %BSA 的 1X PBS
  • (5)1×PBS 缓冲液(RM00012)
  • (6)5× SDS sample buffer
  • (7)Control IgG (AC005/ AC011/AC034)

二、实验步骤

1、样本处理

(1)贴壁培养细胞

  • a. 去除贴壁细胞的培养液,用PBS或无血清培养基清洗1次,低速离心,弃上清,留取沉淀。
  • b. 107细胞加入1ml Cell lysis buffer for IP(已加入蛋白酶抑制剂),移液器轻轻吹打,使裂解液和细胞充分接触。2-8℃旋转15min,20转/min。
  • c. 低温下超声1min。
  • d. 12000rpm,4℃离心10min,小心吸取上清。

(2)悬浮培养细胞

  • a. 低速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。
  • b. 107细胞加入1ml Cell lysis buffer for IP(已加入蛋白酶抑制剂),移液器轻轻吹打,使裂解液和细胞充分接触。2-8℃旋转15min,20转/min,充分裂解后应无明显沉淀。
  • c. 低温下超声1min。
  • d. 12000rpm,4℃离心10min,小心吸取上清。

(3)组织样本

  • a. 把组织剪切成细小的碎片。
  • b. 取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织,迅速用液氮研磨,研磨过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解,按照每100-200mg组织加入1ml Cell lysis buffer for IP(已加入蛋白酶抑制剂)。
  • c. 4℃旋转混匀裂解15min。
    (步骤b,c也可采用以下过程:每100-200mg组织加入1ml Cell lysis buffer for IP(已加入蛋白酶抑制剂)。低温下用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆,直至充分裂解,过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。)
  • d. 低温下超声2min。
  • e. 12000rpm,4℃离心10min,小心吸取上清。
2、磁珠预处理
  • (1)将Protein A/G Magnetic beads颠倒或漩涡混匀,翻转瓶身发现底部无黑色沉淀即可。
  • (2)取10-15μl Protein A/G beads至新的EP管中,放在磁力架上,待溶液澄清后,用移液器吸弃保护液。
  • (3)将EP管从磁分离器上取下来,加入1ml Cell lysis buffer for IP混匀,放置在磁力架上收集磁珠,用移液器吸弃洗杂液,重复2次。
  • (4)将EP管从磁分离器上取下来,加入1mL的3% BSA,置于翻转混合仪4℃封闭1h.
  • (5)重复步骤3),备用。
3、磁珠、抗原-抗体复合物结合
  • (1)将含有抗原的样品(300μl,总蛋白量200-1000μg,剩余体积用 Cell lysis buffer for IP(已加入蛋白酶抑制剂)补齐)中加入目标抗体(0.5-5μg),置于翻转混合仪4℃下反应2h或过夜。
  • (2)将上述完成抗体-抗原结合的复合物与备用好的磁珠进行混合,置于4℃下反应2h。
  • (3)将上述磁珠-抗体-抗原复合物放在磁力架上进行分离,收集上清液,以备后续检测。
  • (4)向离心管中加入1mlCell lysis buffer for IP,用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散,然后进行磁力架分离,弃上清液;从磁力架上取下离心管,重复洗涤3次,共洗涤4次。
4、抗原洗脱

(1)变性洗脱

此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。

  • a. 从磁力架上取下离心管,向其中加入35μl 1X SDS sample Buffer混合均匀,室温静置10min,置于磁力架上进行磁性分离,收集上清液。
  • b. 加入10X DTT,95℃加热10min,进行SDS-PAGE检测。

(2)非变性洗脱

  • a. 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入35μl洗脱液,混合均匀,室温孵育10min。
  • b. 置于磁力架上进行磁性分离,收集洗脱液至新的EP管中。
  • c. 加入中和液中和至pH7.0-8.0。用于后期功能分析。
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