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β-Tubulin Rabbit pAb (AC008)

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Western blot analysis of various lysates, using β-Tubulin Rabbit pAb (AC008) at 1:2000 dilution.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25μg per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 1s.

Immunohistochemistry analysis of paraffin-embedded human liver using β-Tubulin Rabbit pAb (AC008) at dilution of 1:200 (40x lens).Perform high pressure antigen retrieval with 10 mM citrate buffer pH 6.0 before commencing with IHC staining protocol.

Immunohistochemistry analysis of paraffin-embedded human lung cancer using β-Tubulin Rabbit pAb (AC008) at dilution of 1:200 (40x lens).Perform high pressure antigen retrieval with 10 mM citrate buffer pH 6.0 before commencing with IHC staining protocol.

Immunofluorescence analysis of C6 cells using β-Tubulin Rabbit pAb (AC008) at dilution of 1:100 (40x lens). Blue: DAPI for nuclear staining.

Immunofluorescence analysis of NIH-3T3 cells using β-Tubulin Rabbit pAb (AC008) at dilution of 1:100 (40x lens). Blue: DAPI for nuclear staining.

Immunofluorescence analysis of U-2 OS cells using β-Tubulin Rabbit pAb (AC008) at dilution of 1:100 (40x lens). Blue: DAPI for nuclear staining.

All(6)|
货号: AC008
促销价：   ￥520
货    期：现货产品
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折叠内容

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详细信息

推荐稀释比
  • WB1:500 - 1:1000
  • IHC-P1:50 - 1:200
  • IF/ICC1:50 - 1:200
浓度查询

请输入产品标签上的lot号，例如4000000001

反应物种
Human, Mouse, Rat
同种型
IgG
理论分子量
50kDa
实际分子量
55kDa
产品形式
Liquid
偶联物
Unconjugated
存储缓冲液
Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.
Buffer: PBS with 0.05% proclin300,50% glycerol,pH7.3.
阳性样本
293T,SH-SY5Y,Mouse brain,Rat brain
细胞定位
Cytoplasm,cytoskeleton
纯化方式
Affinity purification

抗原信息

免疫原
Recombinant fusion protein containing a sequence corresponding to amino acids 40-260 of human β-Tubulin (NP_006077.2).
序列
SDLQLERISVYYNEASSHKYVPRAILVDLEPGTMDSVRSGAFGHLFRPDNFIFGQSGAGNNWAKGHYTEGAELVDSVLDVVRKECENCDCLQGFQLTHSLGGGTGSGMGTLLISKVREEYPDRIMNTFSVVPSPKVSDTVVEPYNATLSIHQLVENTDETYCIDNEALYDICFRTLKLATPTYGDLNHLVSATMSGVTTSLRFPGQLNADLRKLAVNMVPF
进行序列比对

用户验证的应用

应用及物种
  • WB (Mus musculus , Homo sapiens , Homo sapiens , Rattus norvegicus , blunt snout bream , Sus scrofa , Dianthus caryophyllus L. , Capra hircus , Crassostrea gigas , Gallus gallus , Oncorhynchus mykiss , Eriocheir sinensis H.Milne-Edwards , Brachyura)
  • IF (Mus musculus , Homo sapiens , Rattus norvegicus)
  • IHC (Rattus norvegicus , Mus musculus)

背景信息

This gene encodes a beta tubulin protein. This protein forms a dimer with alpha tubulin and acts as a structural component of microtubules. Mutations in this gene cause cortical dysplasia, complex, with other brain malformations 6. Alternative splicing results in multiple splice variants. There are multiple pseudogenes for this gene on chromosomes 1, 6, 7, 8, 9, and 13.

RRID
AB_2773006
基因ID
203068
Swiss Prot
P07437
别名
M40; TUBB1; TUBB5; CDCBM6; CSCSC1; OK/SW-cl.56; β-Tubulin
研究领域

关联靶点

以TUBB为关键词搜索文献记录，得到上述基因与TUBB的研究紧密相关，排序顺序根据研究相关程度由高到低决定。（所显示数字代表两者共同出现的已发表文献数量）
◀1/▶

关联领域

以TUBB为关键词搜索文献记录，得到上述相关热词信息，可反映出TUBB的研究趋势与热点。（关联领域与基因名称的距离代表其研究热度）

* 该数据来源于赛特新思(citexs.com)
来自于发表文献，仅供参考所用，ABclonal不承担任何责任。

暂无以TUBB为关键词搜索的文献记录。

该服务由赛特新思提供，上述关联分析来自已发表文献，仅供参考所用，ABclonal不承担任何责任。

FAQ

折叠内容

ABclonal公司的抗体，可以回收利用几次？

首先，一般抗体不推荐客户回收利用，抗体使用之后缓冲体系已经发生改变，不同客户在回收抗体的保存条件上也会有差异，所以抗体回收使用效果无法保证。另外，ABclonal公司也做过一批抗体回收验证测试，测试结果显示不同抗体可回收次数不同，一般效价越高的抗体，可重复使用的次数越多，客户可根据实验情况来确定。
注：我们将孵育完毕后剩余的抗体回收到离心管中置于4℃保存，效价高的抗体可至少保存1周，至少重复利用3次。

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ABclonal作为国产抗体品牌的优势？

武汉爱博泰克生物（ABclonal）科技有限公司是国产品牌，她成立于2011年，公司依托ABclonal美国波士顿抗体与蛋白研发中心、中国光谷生物城(武汉)抗体生产基地以及上海张江分子酶研发中心，凝聚了十余位来自哈佛大学、麻省理工、复旦大学、上海交大、中科院生化细胞所和武汉大学的全球知名分子和免疫学方面博士，组成我们的科学家团队，通过聚焦抗体与酶核心技术，致力于打破国际技术的垄断，将公司打造成为科研工具和诊断原料的国内领导品牌，乃至弯道超越国际巨头。 我们拥有包括兔多克隆抗体、小鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体的生产研发平台，同时也有包括WB,IHC,IF,IP,CHIP在内的检测平台，我们对每一支自产的抗体进行了严格的检测。当然，我们部分直销地区也可以帮客户代购进口品牌的产品。同时也有抗体定制服务。ABclonal抗体优势：1，严自检，保质量；2产品多，指标全；3，价格低，货期短。注：ABclonal抗体价格体系详情见附件

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ABclonal抗体成分？

ABclonal抗体成分在平时工作当中，常会有客户咨询我们的抗体用的什么buffer进行保存，一般来说，我们的buffer的成分是：PBS含0.03%的proclin300、0.05%牛血清白蛋白、50%甘油；也有一些是PBS含0.03%的proclin300，50%甘油。防腐剂 Proclin 300活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MCI）和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMCI）。ProClin生物灭活剂能够迅速穿透细胞膜，抑制对细胞呼吸至关重要的特定酶，因此一接触微生物有机体就会立即抑制细胞活性。ProClin的多个特定毒性位点可以防止微生物产生高水平的耐药性。

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实验方案

折叠内容
WB

蛋白质印迹法标准操作流程

一、实验试剂及耗材

1、样品制备试剂
  • a. RIPA 裂解液
  • b. 蛋白酶抑制剂
  • c. BCA工作液
  • d. BSA Standard Solution(5mg/ml)（RM00005）
  • e. 1×PBS缓冲液（RM00012）
  • f. 5×loading buffer（RM00001）
2、制胶试剂
  • a．30% Acr-Bis (29:1)（RM00006）
  • b．1 M Tris-HCl (pH6.8)（RM00003）
  • C．1.5M Tris-HCl (pH8.8)（RM00002）
  • d．10%SDS（RM00004）
  • e．10%Ammonium persulfate (APS)（RM00007）
  • f．TEMED（RM00009）
3、电泳、转膜试剂及耗材
  • a. 1X Tris-Glycine SDS Running Buffer（RM00010）
  • b. 1X Western Transfer Buffer（RM00011）
  • c. Filter Paper (7.5×10cm)（RM00019）
  • d. Nitrocellulose membrane（RM00017/ RM02801/ RM00018）
4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂
  • a. 1XTBST Buffer（RM00013）
  • b. 1X Western Blocking Buffer（RK05742）
  • c. Skimmed milk powder（RM00014）
  • d. Bovine Serum Albumin (BSA)（RM02802）
  • e. Western Antibody Dilution Buffer（RK05743）
  • f. HRP 偶联二抗（AS014/AS003）
  • g. SignalFire™ ECL Reagent（RM00020/RM00021）

二、实验步骤

1、样品制备

（1）细胞收集

  • a. 贴壁培养细胞收集
    去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养基清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
  • b. 悬浮培养细胞收集
    速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。手指轻弹细胞，使其松散。
  • c. 组织样本收集
    把组织剪切成细小的碎片，越小越好。取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。

（2）总蛋白提取

  • a. 细胞/组织裂解
    将装有细胞沉淀或组织碎片的容器完全插入冰中。细胞沉淀按照1mL裂解液/107个细胞(1个T75培养瓶细胞量)的比例加入相应体积的裂解液（细胞量足够时都加入3mL，不足时根据细胞量计算），裂解20min，每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s。组织碎片按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重复5次，使组织尽量碾碎。（裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂）。
  • b. 离心
    把裂解好的样品配平后，置于预冷的高速冷冻离心机中，12000 rpm，15min。
  • c. 蛋白变性
    完成离心后，上清即为蛋白提取液。吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入1/5上清体积的5×Loading Buffer（最终工作液为1X），待干式恒温器温度升至95℃后，将1.5mL离心管插入加热孔中，95℃加热变性10min，待液体完全冷却后置于-20℃保存。

（3）蛋白浓度测定（BCA法）

  • a. BCA工作液的配置
    根据样品数量，按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B（50:1）配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。
  • b. 标准品测定
    取10μl蛋白标准品（5mg/ml BSA）稀释至50μl，使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1*PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中，加稀释液补足到20μl（见附表）。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，如果样本不足20μl，需加稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
2、凝胶电泳

（1）制胶器安装

  • 根据使用说明书安装。

（2）分离胶制备

  • 根据不同蛋白大小，选择不同浓度的分离胶（见附件表）。将制备好的胶溶液注入预先安装好的制胶器中，加入异丙醇封胶。室温水平放置30min左右。注意防止胶溶液产生气泡并注入制胶器中；注胶前再加入TEMED，防止注胶前凝固；注入异丙醇时需沿玻板一边缓慢拖动加入。

（3）浓缩胶制备

  • 分离胶凝固后，沿玻板一边倒出异丙醇，并用滤纸吸干。再根据需要的体积制备浓缩胶（见附表）。将制备好的胶溶液注入制胶器中，并把准备好的样品梳沿玻板一端缓慢插入胶溶液中，室温水平放置20-30min。注意样品梳与胶溶液之间避免气泡产生。

（4）上样

  • 待浓缩胶凝固好后，双手垂直拔出样品梳，并用Tris-Glycine SDS Running Buffer注入到内外槽中，形成闭合回路。用移液器吸取样品垂直梳孔上样，蛋白含量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm即可。

（5）电泳

  • 上样完以后，连通电泳仪电源，注意正负极需连接正确，设定适宜的电泳参数，浓缩胶电泳参数为恒压80V，待样本进入分离胶是，可将电泳调至120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时，停止电泳，关闭电泳仪电源，或根据目的蛋白分子量大小参照Marker电泳情况延长电泳时间。
3、转膜

（1）准备工作

  • a. Western Transfer Buffer至少提前2h （即开始电泳后）放入-20℃冰箱预冷，但注意避免结冰。
  • b. 根据胶体大小,将Filter Paper及Nitrocellulose membrane剪裁至合适尺寸。
  • c. 目的蛋白＞20KD选择0.45μm NC膜/PVDF膜；目的蛋白＜20KD选择0.2μmNC膜或PVDF膜，选择完毕后将NC膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用，注意如使用的是PVDF膜需先放入甲醇中浸泡5-10min，再放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

（2）转膜

  • 取出玻板中的凝胶，在夹板上依次放一块多孔垫、三张滤纸、凝胶、膜、三张滤纸、一块多孔垫（“三明治”结构），将转好的膜放在转膜槽，按一定的条件进行转膜。（见附表）
4、封闭
  • 将膜从“三明治”结构中取出，放入合适的抗体孵育槽中，加入Western Blocking Buffer室温孵育1h，一张6.3×8.3cm大小的膜加入6~7ml即可。
5、一抗孵育
  • a. 将一抗用1X Western Blocking Buffer/1XTBST Buffer按照合适比例进行稀释。
  • b. 封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中，室温2h或4℃过夜。
6、洗涤
  • 一抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。
7、二抗孵育
  • a. 一抗洗涤结束前10min，将二抗用1XTBST Buffer按照合适比例进行稀释。
  • b. 洗涤结束后，将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中，室温1h。
8、洗涤
  • 二抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。
9、曝光
  • a. 根据膜的大小，按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液，按比例吸取等体积的 SolutionⅠ和 SolutionⅡ混匀，配制成发光检测工作液。
  • b. 用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上，使其均匀覆盖，室温孵育 1-2min，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
  • c. 压片检测：将膜固定于片夹内。暗室内压片 1 分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30s、60s、90s、180s，然后一起显影定影观察结果。
  • d. 荧光成像仪检测：将膜放置到荧光成像仪内，参考仪器说明书进行检测。

附表1：BSA标准品稀释

1mg/ml BSA(μl) 稀释液(μl) 对应的蛋白含量（mg/ml）
0 20 0
1 19 0.05
2 18 0.1
4 16 0.2
8 12 0.4
12 8 0.6
16 4 0.8
20 0 1

附表2：分离胶浓度的选择

分子量（kDa) 分离胶浓度
X≤10 15%
10<X≤15 13.5%
15<X≤25 12%
25<X≤35 11%
35<X≤40 10%
40<X≤55 9%
55<X≤70 8%
70<X≤100 7%
100<X 6%
备注：X为目的蛋白大小

附表3：分离胶配制

分离胶浓度 6% 7% 8% 9% 10% 11% 12% 13.5% 15%
去离子水（mL） 5.3 4.9 4.6 4.3 4.0 3.65 3.3 2.8 2.3
30%丙烯酰胺 （mL） 2 2.4 2.7 3.0 3.3 3.65 4.0 4.5 5.0
1.5M Tris-HCL(pH8.8) （mL） 2.5
10%SDS（mL） 0.1
10%AP（mL） 0.1
TEMED（mL） 0.01
总体积（mL） 10

附表4：浓缩胶配制

5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶
去离子水（mL） 1.1 2.1 2.7 3.4 4.1
30%丙烯酰胺 （mL） 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0
1.0M Tris-HCL(pH6.8) （mL） 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75
10%SDS（mL） 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
10%AP（mL） 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
TEMED（mL） 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006
总体积（mL） 2 3 4 5 6

附表5：转膜条件选择

分子量（kDa) 转膜条件
X≤10 恒流200mA,30min
10 < X≤15 恒流200mA,40min
15< X≤20 恒流200mA,50min
20< X≤50 恒流200mA, 1kDa/min+20min
50< X≤100 恒流200mA, 1kDa/min+30min
100< X≤150 恒流250mA, 1kDa/min+20min
150< X≤180 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在3h内)
180< X 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在4h内)
备注：X为目的蛋白大小
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IHC-P

IHC实验标准操作流程

一、实验仪器及试剂

1、实验仪器
  • 微波炉：格兰仕 P70D2OTL-D4
  • 展示柜：澳柯玛 SC-187(NE)
  • 恒温箱：武汉瑞华仪器 DHP600
  • 显微镜：尼康E200
2、实验试剂
缓冲液 0.01M PBS
0.01M PBST
修复液 0.01M PBS修复液（pH7.2）
0.01M Tris-EDTA修复液（pH9.0）
0.01M 柠檬酸修复液（pH6.0）
封闭液 5%BSA
3、实验工具

擦片纸、移液器、孵育湿盒、抗原修复盒等。

二、石蜡切片IHC实验流程

1．烤片：
  • （1）在切片右侧空白处用铅笔写好抗体名称，兔号，实验安排日期，实验安排序号，抗体稀释比和组织名（组织芯片可省略）;
  • （2）将石蜡切片按同一朝向放置在金属切片架上；
  • （3）将其放入55℃的恒温箱中烤片30min；同时将脱蜡液0缸一起放入55℃的恒温箱中;
  • （4）恒温箱设置温度在55-60℃之间，烤片时间不能超过1h。
2．脱蜡至水：
  • （1）将石蜡切片连同金属切片架一起放入脱蜡液0缸中,再一起从恒温箱中取出，5min后，将其浸入到放置在通风橱中的脱蜡液1玻璃缸中，并按照脱蜡液1、脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将装有石蜡切片的金属切片架分别放入玻璃缸中进行梯度脱蜡，每缸5-7min。完成后检查切片脱蜡完全后用流水冲洗；
  • （2）流水冲洗时水流不能直接对着切片；
  • （3）在脱蜡过程中需要开启通风橱的通风功能，通风橱电源开关设置在实验室门外墙面的配电箱处；
  • （4）在通风橱工作时，不要将移动玻璃下拉到底，需要留10-20cm间隙进行气体交换。
3．灭活：
  • （1）提前新鲜配制3%的双氧水；
  • （2）将脱蜡至水后的石蜡切片，完全浸入到双氧水中室温灭活处理10min，完成后流水冲洗，冲洗时水流不能直接接触切片；
  • （3）内源性酶含量高的组织，可以灭活15-20min；
  • （4）双氧水需新鲜配制，不可长期使用。
4．抗原修复：
  • （1）将切片放入盛有修复液（一般情况下用PBS）的修复盒中，修复液需完全浸没组织切片；
  • （2）然后将抗原修复盒盖上盖子，并放入微波炉，高火加热3min至沸腾后停火，保温5min；
  • （3）再高火加热3min至沸腾后停火，保温5min；
  • （4）随后中低火加热1min至沸腾后停火，保温5min，然后将切片连同抗原修复盒拿出至室温冷却。
5．封闭：
  • （1）待修复液温度降至室温，从修复盒中取出切片；
  • （2）将切片上的水甩干，并用擦片纸将组织周边的水擦拭干净；
  • （3）用滴瓶在组织切片上滴加5%的羊血清封闭液，试剂需要完全覆盖组织；
  • （4）然后将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于37℃恒温箱孵育20min；
  • （5）擦片要求：切片上无水无纸屑，组织完整无损伤。
6．一抗孵育（自带HRP标记）：
  • （1）取出切片，甩掉封闭液；
  • （2）用移液器直接在组织切片上滴加合适浓度的一抗，一抗需完全覆盖组织，完全覆盖标准：为液面边缘比组织边缘宽出1-2mm的间距；
  • （3）将切片水平放置于孵育湿盒中，于4℃冰箱孵育过夜（或37℃恒温箱孵育2h）；
  • （4）之后将孵育湿盒取出复温15-30min，然后将切片取出置于卧式洗槽中，用PBST洗涤5min×1次，PBS洗涤5min×3次；
  • （5）一抗工作液需提前准备，用抗体稀释液稀释一抗；
  • （6）一抗滴加应准确快速，不能出现干片的情况。
7．显色：
  • （1）显色前5分钟，按照DAB产品说明书上的配方提前配置新鲜DAB显色工作液；
  • （2）然后将切片用蒸馏水洗涤一次，之后擦干组织切片，并在组织上滴加显色工作液，显色液需完全覆盖组织；
  • （3）显微镜下观察显色变化情况并控制显色终点（信噪比最高时终止），大量水洗终止显色；
  • （4）显色过程中需严格控制显色背景。
8．复染返蓝：
  • （1）将洗涤后的切片于高温下干燥；
  • （2）然后将组织切片完全浸入Mayor苏木素复染2min，再沥干1min后，水洗终止染色；
  • （3）然后于自来水浸泡5min进行返蓝；
9．封片：
  • （1）取出晾干后，在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片；
  • （2）封片要求：中性树胶不溢不漏，不能出现干封，盖玻片端正不歪斜，且组织上无气泡。
10.记录：
  • （1）在实验记录本上记录实验条件，实验步骤，实验说明
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IF/ICC

免疫荧光实验操作流程（细胞样本）

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

4℃冰箱、恒温恒湿箱、通风橱、移液器、避光孵育湿盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液：0.01M pH7.2±0.2 TBS ；0.01M pH7.2±0.2 TBST
    试剂名称 1*TBS/L 试剂名称 1*TBST/L
    Tris 1.21g 1*TBS 1L
    NaCl 8.8g Tween 20 溶液 0.001L
    用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
  • (2) 固定液：4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制）
  • (3) 抗体稀释液：1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
  • (4) 通透剂：0.3% Triton X-100（TBS缓冲液配制）
  • (5) 二抗（可选）：
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074；
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073；
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077；
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076；
  • (6) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制）
  • (7) 去离子水（dH2O）、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1．样本前处理
  • (1) 弃去培养基，在细胞上缓慢加入常温TBS，清洗2次，每次5秒；
  • (2) 细胞固定：在细胞上覆盖 4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制），置于4℃，固定15min；固定液需足量；
  • (3) 固定液的清洗：去除固定液，使用4℃预冷的TBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟；
注意：需避免实验操作时温差过大或温度骤变；固定液需保证足量，可过量使用；甲醛有毒性，加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作。
2．染色步骤
  • （1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
  • （2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于4℃孵育过夜；
  • （3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2±0.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：TBS缓冲液体积比1:500，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （6）细胞孔板可直接加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞涂片滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞爬片可取出，盖在滴加抗荧光衰减封片剂的载玻片上后，于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意：实验中，所有试剂滴加应准确、快速、足量，不能出现干片的情况；染色步骤从二抗孵育开始，后续所有步骤都需注意避光操作；染色完成后需及时观察并采集图像，避免干燥和荧光物质淬灭。

免疫荧光实验操作流程（石蜡切片）

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、移液器、避光孵育湿盒、抗原修复盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液：0.01M pH7.2±0.2 TBS ；0.01M pH7.2±0.2 TBST
    试剂名称 1*TBS/L 试剂名称 1*TBST/L
    Tris 1.21g 1*TBS 1L
    NaCl 8.8g Tween 20 溶液 0.001L
    用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
  • (2) 修复液（可选）：
    pH6.0 0.01M柠檬酸修复液（1L）：C6H8O7•H2O 0.4g；NaC6H5O7•2H2O 3g；pH6.0；
    pH7.0 0.01M PBS修复液（1L）：KH2PO4 0.07g；NaCl 7.89g；Na2HPO4 0.45g；KCl 0.10g；pH7.2-7.4；
    pH8.0 0.05M Tris-EDTA修复液（1L）：C4H11NO3 6.05g；C10H14N2Na2O8•2H2O 0.29g；用稀HCl调至pH8.0；
    pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液（1L）：C4H11NO3 1.21g；C10H14N2Na2O8•2H2O 0.37g；pH9.0。
  • (3) 封闭液：5%空白山羊血清
  • (4) 抗体稀释液：1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
  • (5) 二抗：
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074；
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073；
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077；
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076；
  • (6) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2±0.2 TBS配制）
  • (7) 去离子水（dH2O）、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1．水化/脱蜡：
  • (1) 烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；
  • (2) 脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟。
注意：流水清洗时水流不能直接对着切片；操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
2．抗原修复：
  • （1）方法一，微波热修复：将切片浸入盛有修复液的修复盒中，将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上；整体放入微波炉中，高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；再高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；随后中低火加热1分钟后停火，微波炉内静置5分钟，然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。
    注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开微波炉门；修复完成后不可快速冷却；修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
  • （2）方法二，高压热修复：在高压锅中，加入抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时2分钟；计时结束后离开热源，自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后，用缓冲液洗涤3次，每次1min。
    注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
3．染色：
  • （1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
  • （2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于4℃孵育过夜；
  • （3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：0.01M pH7.2 TBS缓冲液体积比1:500，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （6）滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意：实验中，所有试剂滴加应准确、快速、足量，不能出现干片的情况；染色步骤从二抗孵育开始，后续所有步骤都需注意避光操作；染色完成后需及时观察并采集图像，避免干燥和荧光物质淬灭。
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