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Agarose beads-conjugated anti-GFP VHH Single Domain antibody (AE074)

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Immunoprecipitation analysis of 100 μg extracts of Eukaryotic expression of GFP using 30ul Anti-GFP(Nanobody) Agarose Beads antibody (AE074). Western blot was performed from the immunoprecipitate using Mouse anti GFP-Tag mAb (AE012) at a dilution of 1:10000

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货号: AE074
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详细信息

推荐稀释比
  • IP30μl Anti-GFP(Nanobody) Agarose Beads antibody for 100μg extracts of recombinant protein
  • CoIP500 μL (20 reactions)
  • RIP500 μL (20 reactions)
  • ChIP500 μL (20 reactions)
浓度查询

请输入产品标签上的lot号，例如4000000001

反应物种
Species independent
同种型
VHH
理论分子量
27kDa
实际分子量
30kDa
产品形式
Liquid
偶联物
Agarose Beads
存储缓冲液
Store at 4℃. Avoid freeze / thaw cycles.
Buffer: 0.03% sodium azide,20% ethanol
纯化方式
Affinity purification

抗原信息

免疫原
Recombinant protein of GFP.
序列
Email for sequence
进行序列比对

用户验证的应用

应用及物种
  • ChIP (Arabidopsis thaliana , Gossypium spp)
  • Co-IP (Arabidopsis thaliana , Oryza sativa)
  • RIP (Arabidopsis thaliana)
  • WB (Solanum lycopersicum , Triticum aestivum , Homo sapiens , Nicotiana benthamiana , Gossypium spp)
  • IF (Homo sapiens)

背景信息

The green fluorescent protein (GFP) is a protein composed of 238 amino acid residues (26.9 kDa) that exhibits bright green fluorescence when exposed to light in the blue to ultraviolet range. Although many other marine organisms have similar green fluorescent proteins, GFP traditionally refers to the protein first isolated from the jellyfish Aequorea victoria. The GFP from A. victoria has a major excitation peak at a wavelength of 395 nm and a minor one at 475 nm. Its emission peak is at 509 nm, which is in the lower green portion of the visible spectrum. The GFP from the sea pansy (Renilla reniformis) has a single major excitation peak at 498 nm. GFP makes for an excellent tool in many forms of biology due to its ability to form internal chromophore without requiring any accessory cofactors, gene products, or enzymes / substrates other than molecular oxygen.In cell and molecular biology, the GFP gene is frequently used as a reporter of expression. It has been used in modified forms to make biosensors, and many animals have been created that express GFP, which demonstrates a proof of concept that a gene can be expressed throughout a given organism, in selected organs, or in cells of interest. GFP can be introduced into animals or other species through transgenic techniques, and maintained in their genome and that of their offspring. To date, GFP has been expressed in many species, including bacteria, yeasts, fungi, fish and mammals, including in human cells.

RRID
AB_2863798
别名
GFP;GFP tag;GFP-tag

FAQ

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ABclonal公司的抗体，可以回收利用几次？

首先，一般抗体不推荐客户回收利用，抗体使用之后缓冲体系已经发生改变，不同客户在回收抗体的保存条件上也会有差异，所以抗体回收使用效果无法保证。另外，ABclonal公司也做过一批抗体回收验证测试，测试结果显示不同抗体可回收次数不同，一般效价越高的抗体，可重复使用的次数越多，客户可根据实验情况来确定。
注：我们将孵育完毕后剩余的抗体回收到离心管中置于4℃保存，效价高的抗体可至少保存1周，至少重复利用3次。

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ABclonal作为国产抗体品牌的优势？

武汉爱博泰克生物（ABclonal）科技有限公司是国产品牌，她成立于2011年，公司依托ABclonal美国波士顿抗体与蛋白研发中心、中国光谷生物城(武汉)抗体生产基地以及上海张江分子酶研发中心，凝聚了十余位来自哈佛大学、麻省理工、复旦大学、上海交大、中科院生化细胞所和武汉大学的全球知名分子和免疫学方面博士，组成我们的科学家团队，通过聚焦抗体与酶核心技术，致力于打破国际技术的垄断，将公司打造成为科研工具和诊断原料的国内领导品牌，乃至弯道超越国际巨头。 我们拥有包括兔多克隆抗体、小鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体的生产研发平台，同时也有包括WB,IHC,IF,IP,CHIP在内的检测平台，我们对每一支自产的抗体进行了严格的检测。当然，我们部分直销地区也可以帮客户代购进口品牌的产品。同时也有抗体定制服务。ABclonal抗体优势：1，严自检，保质量；2产品多，指标全；3，价格低，货期短。注：ABclonal抗体价格体系详情见附件

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ABclonal抗体成分？

ABclonal抗体成分在平时工作当中，常会有客户咨询我们的抗体用的什么buffer进行保存，一般来说，我们的buffer的成分是：PBS含0.03%的proclin300、0.05%牛血清白蛋白、50%甘油；也有一些是PBS含0.03%的proclin300，50%甘油。防腐剂 Proclin 300活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MCI）和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMCI）。ProClin生物灭活剂能够迅速穿透细胞膜，抑制对细胞呼吸至关重要的特定酶，因此一接触微生物有机体就会立即抑制细胞活性。ProClin的多个特定毒性位点可以防止微生物产生高水平的耐药性。

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实验方案

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IP

IP检测（琼脂糖偶联磁珠、亲和凝胶偶联磁珠）

一、实验试剂

  • （1）Agarose Beads,or Affinity Gel
  • （2）裂解液&洗杂液：Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)（RM00022）
  • （3）蛋白酶抑制剂(RM02916)
  • （4）1×PBS 缓冲液(RM00012)
  • （5）5×loding buffer（RM00001）（使用时用去离子水稀释至工作浓度即可）
  • （6）洗脱液：0.1-0.2M甘氨酸，pH:2.5-3.1
  • （7）中和液：1M Tris-base pH:10.4

二、实验步骤

1、样本处理

（1）贴壁培养细胞

  • a. 去除贴壁细胞的培养液，用PBS或无血清培养基清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
  • b. 107细胞加入1ml Cell lysis buffer for IP（已加入蛋白酶抑制剂）,移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。2-8℃旋转15min，20转/min。
  • c. 低温下超声1min。
  • d. 14000g，4℃离心10min，小心吸取上清。

（2）悬浮培养细胞

  • a. 低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
  • b. 107细胞加入1ml Cell lysis buffer for IP（已加入蛋白酶抑制剂），移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。2-8℃旋转15min，20转/min，充分裂解后应无明显沉淀。
  • c. 低温下超声1min。
  • d. 14000g，4℃离心10min，小心吸取上清。

（3）组织样本

  • a. 把组织剪切成细小的碎片。
  • b. 取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解,按照每100-200mg组织加入1ml Cell lysis buffer for IP（已加入蛋白酶抑制剂）。
  • c. 4℃旋转混匀裂解15min。
    （步骤b，c也可采用以下过程：每100-200mg组织加入1ml Cell lysis buffer for IP（已加入蛋白酶抑制剂）。低温下用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。）
  • d. 低温下超声2min。
  • e. 14000g，4℃离心10min，小心吸取上清
2、Beads预处理
  • （1）将 Agarose Beads,or Affinity Gel颠倒或漩涡混匀（溶液无分层）。
  • （2）取30-40μl Agarose Beads,or Affinity Gel至新的EP管中，加入500ul 预冷的Cell lysis buffer for IP,4℃、1200g离心2分钟，去掉上清，重复2次，共洗涤3次，。
3、结合蛋白
  • （1）将含有抗原的样品（通常300μl，总蛋白200-500μg或者纯化后蛋白20μg左右）加入已处理好的Agarose Beads,or Affinity Gel中，置于翻转混合仪4℃下反应2h或过夜。
  • （2）将上述完成孵育的复合物，4℃、1200g离心2分钟，弃上清。
  • （3）加入500ul预冷的 Cell lysis buffer for IP (已加入蛋白酶抑制剂),4℃、1200g离心2分钟，去掉上清，重复3次，共洗涤4次。
4、抗原洗脱

（1）变性洗脱

此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。

  • a. Agarose Beads,or Affinity Gel去除上清后，向其中加入35μl 1X SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，95℃加热10min。
  • b. 1200g离心2分钟，收集上清液进行SDS-PAGE检测。

（2）非变性洗脱

  • a. Agarose Beads,or Affinity Gel除上清后，加入50μl洗脱液，混合均匀，室温孵育5min。
  • b. 1200g离心2分钟，收集上清液至新的EP管中。
  • c. 加入中和液中和至pH7.0-8.0。用于后期功能分析。
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ChIP

CHIP标准操作流程

一、实验试剂

  • （1）PBS缓冲液（RM00012）
  • （2）甲醛 16%
  • （3）Sonication ChIP Kit（RK20258）
    A. Glycine Sonication（10X）（RM20700）
    B. Cell Swelling Buffer（10X）（RM20701）
    C. ChIP Sonication Buffer (10X)（RM20702）
    D. ChIP Low Salt Wash Buffer (10X) （RM20703）
    E. ChIP High Salt Wash Buffer (5X) （RM20704）
    F. LiCl Buffer (5X) （RM20705）
    G. TE Buffer (100X) （RM20706）
    H. ChIP Elution Buffer （RM20707）
    I. 5 M NaCl （RM20708）
    J. 1 M DTT （RM20164）
    K. Proteinase K （RM20713）
    L. RNase A (RM20709）
  • （4）蛋白酶抑制剂（RM02916）
  • （5）ChIP Grade Agarose Beads

二、实验步骤

1、裂解
  • （1）取1x107细胞于1.5ml EP管，加入1ml PBS和62.5μl甲醛（16%）混匀后，于冰上放置10min（混匀2-3次）。
    （如果样本为组织样本（1）步骤更改为：取100-200mg组织于1.5ml EP管，用剪刀剪碎成2-3mm大小碎块，并保持样品处于冰上或低温，防止蛋白降解。加入1ml PBS，组织Dounce匀浆至无明显组织块可见，加入62.5μl甲醛（16%）混匀后，于冰上放置15min（混匀3-5次）。）
  • （2）加入100μlGlycine Sonication（10X）,混匀后冰上静置5min，中止交联，轻摇混匀。
  • （3）4℃，1200g 离心5min收集细胞，用1ml PBS缓冲液漂洗2遍。
  • （4）加入1ml 1X Cell Swelling Buffer（已加入蛋白酶抑制剂和DTT），置于旋转摇床4℃裂解10min。
  • （5）4℃，5000g离心5min收集细胞核沉淀。
  • （6）加入1ml 1X Cell Swelling Buffer（已加入蛋白酶抑制剂和DTT）,置于旋转摇床4℃裂解5min。
  • （7）4℃，5000g离心5min收集细胞核沉淀。
  • （8）1ml 1X ChIP Sonication Buffer（已加入蛋白酶抑制剂）重悬沉淀，4℃旋转孵育20min,，混匀后超声15-20min。
  • （9）4℃，12000g离心10min取上清，吸取少量裂解液DNA解交联后回收检测（具体步骤同后文IP-7~8）。
  • （10）琼脂糖电泳检测DNA打断程度，理想DNA长度在200-700 bp之间。
  • （11）使用Qubit™荧光定量仪检测染色质浓度，理想浓度在50-200ng/µl。
注意：整个过程在低温下进行，超声条件根据检测结果进行调整。
2、免疫沉淀：
  • （1）染色质样本用 1X ChIP Sonication Buffer（已加入蛋白酶抑制剂）补至总体积500μl 。
  • （2）取25μl作为Input样本，-20℃暂存。
  • （3）取30-50μl ChIP Grade Agarose Beads，加入500μl 1X ChIP Sonication Buffer，4℃、1200g离心2min，小心弃去上清，重复洗一次。
  • （4）加入（1）步骤中稀释好的染色质样本4℃旋转孵育2h（每个实验管对应设置同型IgG对照）。
  • （5）依次使用1XChIP Low Salt Wash Buffer, ChIP High Salt Wash Buffer, LiCl Buffer, 洗涤Agarose Beads 2次。
  • （6）弃去上清后加入150μl Elution buffer于65℃孵育30min（混匀5-6次）。4℃、1200g离心2min，小心吸取上清。
  • （7）加入6μl 5M NaCl和RNase A 37℃消化30min，2μl Proteinase K，65℃水浴4h。
  • （8）使用DNA回收试剂盒回收DNA。
注意：每份IP样本应含DNA的量为5-15ug DNA(转录因子15-20ug)，抗体加入量为2-5ug,可根据实验进行优化。
3、Q-PCR：

（1）反应体系 (20ul)

DNA模板： 5 μl
引物： 5 μl
Green Master Mix: 10 μl

（2）反应程序

Stage 1 预变性 a Reps: 1 95 ℃ 5 min
Stage 2 循环反应 b Reps: 40 95 ℃ 10 sec
60 ℃ 30 sec
Stage 3 融解曲线 Reps: 1 95 ℃ 15 sec
60 ℃ 60 sec
95 ℃ 15 sec
4、结果计算

假设 Input 起始浓度为 a，Ct1 个循环数扩增后达到阈值；IgG 起始浓度为 b，Ct2 个循环数扩增后达到阈值；目的蛋白起始浓度为 c，Ct3 个循环数扩增后达到阈值。则可以得到如下公式：

a×2Ct1 = b×2Ct2 = c×2Ct3
b/a = 2Ct1/2Ct2 = 2（Ct1-Ct2） b：a=2（Ct1-Ct2）
c/a = 2Ct1/2Ct3 = 2（Ct1-Ct3） c：a=2（Ct1-Ct3）
检测结果=2（Ct1-Ct3）/2（Ct1-Ct2）
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