E.coli DNA Ligase (RK20501)

A1：反应体系内无ATP或Mg2+：使用随酶提供的反应Buffer或向其它兼容的Buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是rATP，而不是dATP，因为后者不起作用。

A2：反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高：纯化DNA。

A3：去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。

A4：DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA：保持总DNA浓度在1-10 μg/mL之间。

A5：连接末端为单碱基突出末端：提高连接酶用量或者使用高浓度T4 DNA连接酶在16°C过夜连接。

A6：插入片段和质粒没有磷酸化：假如载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。

A7：加入过多的连接混合物至感受态细胞：50 μL感受态细胞应加入1~5 μL连接混合物。

A8：插入片段太大，不能进行环化：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。

A9：T4 DNA连接酶失活：用HindIII酶切的λDNA或其它经过验证的底物进行检测。

A10：通过热失活以终止连接反应：连接反应完成后可直接进行转化，不需热失活终止连接，否则会显著降低转化效率。

A11：感受态细胞失活或者转化效率低：连接效率与感受态细胞状态呈正相关，实验前验证感受态细胞的转化效率。

A12：载体与连接片段比例不合适：对于单片段插入的连接反应，插入片段/线性化载体摩尔比在2-6时，连接效果最佳，低于2会显著降低连接效率，高于6会导致多片段连接的副反应，如果DNA浓度不确定（即摩尔比不确定），可能由于不同的摩尔比，导致不同的连接产物。

A13：电转的连接产物未纯化：若电转，连接产物需纯化后再进行电转化。

插入片段比载体片段的摩尔数更多；

加入更多的连接酶，最好使用高浓度的连接酶；

线性化载体需要进行去磷酸化处理；

15％的PEG8000可以提高连接效率和减少线性化载体自连；

反应体系控制尽量控制在10 μL；

去磷酸化步骤根据酶的性质而定，一般要反应一个小时，在反应半小时后补充酶再反应半小时；

插入片段与载体尽量使用限制性内切酶酶切完全；

低温长时间的连接效率比室温短时间连接的效果好，在4℃连接两天的效率比16℃连接过夜更高。

连接反应的温度：DNA连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是16℃连接过夜。

DNA的平未端和粘性末端：由于限制性内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。

碱性磷酸酶处理的载体：为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA 自生连接问题，为此通常选择对线性化载体用碱性磷酸酶处理，除去５’末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

连接反应的检测：连接反应成功与否，需要转化感受态细胞，通过阳性克隆的筛选来确定。如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。