服务介绍

实验原理


WB(Western Blot)即蛋白印迹法,其原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息,是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。

服务优势


  • 严格规范的SOP,确保实验过程无误。
  • 专业的数据分析,计算出浓度接近样本真实情况。
  • 完整的检测报告,包含真实的原始数据、专业结果分析、实验相关器材。
  • 2000种免费的抗体,专业的服务,为您降低科研成本!

服务承诺


  • 本公司会在最短的时间内快速将实验完成。
  • 本公司会根据总蛋白定量的结果,微调各个样本间浓度差异,高温变性,加入loading buffer,上样跑胶,以及转膜显色等步骤。
  • 本公司会利用软件对所得胶片进行扫描,用相对定量方法进行定量分析时,要对管家蛋白等参比蛋白进行同样操作,用所得到的值进行蛋白量的校正,最后求得目的蛋白的相对表达量。
  • 本公司会提供实验报告:包括详细的实验方法及western blot结果的相关图表。
  • 本公司保证检测结果准确、客观、可信,但不能确保一定要得到某特定结果。

客户提供


  • 客户须在实验开始前确保其细胞或组织中有目的蛋白的表达,并提供目的蛋白的相关信息(蛋白名称、大小等信息),尽可能详细的背景资料,包括蛋白的种属、大小、参考文献等。
  • 客户应对所提供的材料及信息负责,如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或经济损失由客户承担
  • 新鲜样品(组织为100-150 mg/样,细胞>107 个/样),若为冻存样品,请于-70 ℃以下保存并自备液氮以便运输。一抗,标明来源和稀释度,也可让我司代买。
  • WB所需要的目的蛋白的一抗,可自行提供,或在本公司购买相应指标。

技术路线

蛋白免疫印迹一般由样本处理、凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测组成。

常见问题

常见问题


常见问题 可能原因 解决方法
条带呈笑脸状 凝胶不均匀冷却,电泳时中间比两侧更热 降低电泳时的电压
条带呈皱眉状 凝胶和玻璃挡板底部有气泡;两遍聚合不完全 电泳槽中加电泳液时排空玻璃挡板下方的气泡;配胶时充分混匀
拖尾 样本中蛋白溶解不好 上样前对样本煮沸5min,离心1min
出现纹理
(纵向条纹)
样本中含有不溶性颗粒 上样前对样本煮沸5min,离心1min
条带偏斜 电极不平衡或者加样位置偏斜;凝胶不均匀凝固 在未加样孔中加入等量样品缓冲液,配胶时充分混匀
条带弥散 上样时样品被电泳缓冲液稀释;浓缩胶配制出错或梳齿底部过短 上样时自底部往上缓缓加样;使用新配制AP,按照配方配浓缩胶;梳齿底部至分离胶顶约1.0~1.5cm
条带宽窄不均 蛋白浓度不同,上样时体积差异过大 浓度高的样本中补充1*上样缓冲液至各样本体积大致相同
没有阳性条带 一抗或二抗失效 更换抗体,选择现配现用工作液
一抗/二抗不匹配 更改为同种属及同亚型的抗体底物
发光液失效 更换新的发光液
标本中不含目的蛋白或目的蛋白含量太低 设置阳性对照,确定样本中是否含靶蛋白;增加标本上样量解决靶蛋白含量低
抗体染色不充分 增加抗体浓度;延长孵育时间
溶液中有辣根过氧化酶抑制剂 所有溶液和器皿中避免含有叠氮化钠
抗体活性降低 选择在有效期内的抗体;工作液现配现用,避免长时间放置
有阳性条带,但条带比较弱 样本中目的蛋白含量太低 增加标本上样量
洗膜过度 缩短洗涤时间
曝光时间过短 延长曝光时间
封闭过度 减少封闭剂的量或缩短时间;换用不同封闭剂类型
蛋白转移不充分 优化转膜条件;调整转膜时间;严格按照配方配制转膜液体;如为PVDF膜,需提前用100%甲醛浸泡
背景高 洗膜不充分 增加洗液体积和洗涤次数;洗涤液中加入Tween-20
二抗浓度过高 降低二抗浓度
二抗的非特异性背景 不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否由二抗系统来源;重新选择二抗
封闭不充分 增加封闭液孵育时间,或者提高温度。选择合适的封闭试剂
抗体与封闭蛋白有交叉反应 更换封闭剂;洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应
曝光过度
检测过程中膜干燥
缩短曝光时间
保证充分的反应液,避免出现干膜现象
非特异性条带(多条带) 抗体浓度过高 降低抗体(一抗、二抗)浓度
一抗的特异性不够 使用单克隆或者亲和纯化的抗体,保证抗体的特异性
二抗的非特异性结合 不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否由二抗系统来源;重新选择二抗
蛋白上样量过大 降低上样量
蛋白降解 避免反复冻融;使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂
不同剪切体存在 分析不同剪切体的大小并核对
细胞传代过多,导致蛋白变异 使用原代或传代少的细胞作对照
背景有不均匀白色斑点 转膜过程中有气泡存在 仔细检查,避免存在气泡
抗体分布不均匀 孵育抗体时使用摇床
报价表
  1. 您可以通过电子邮件、电话或在线与我们联系。
  2. 对于批量订单,请发送至邮箱cn.market@abclonal.com,欢迎电话垂询400-999-6126。