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Affinity Gel-conjugated Mouse anti DDDDK-Tag mAb {Anti-Flag 亲和凝胶} (AE061)

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Immunoprecipitation analysis of 300ug extract cell lysate from 293T cells transfected with GSK3B expression vector containing a DDDDK-tag with 30uL Affinity Gel-conjugated Mouse anti DDDDK-Tag mAb antibody（AE061).Western blot was performed from the immunoprecipitate using Rabbit anti DDDDK-Tag antibody at 1:10000 dilution.

Immunoprecipitation analysis of 300ug extract cell lysate from 293T cells transfected with IRF1 expression vector containing a DDDDK-tag with 30uL Affinity Gel-conjugated Mouse anti DDDDK-Tag mAb antibody（AE061).Western blot was performed from the immunoprecipitate using Rabbit anti DDDDK-Tag antibody at 1:10000 dilution.

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货号: AE061
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详细信息

推荐稀释比
  • Binding Cap1.1 mg Flag protein/mL
浓度查询

请输入产品标签上的lot号，例如4000000001

反应物种
Species independent
同种型
IgG2b,Kappa
实际分子量
Refer to Figures
克隆号
AMC0382
产品形式
Liquid
偶联物
Affinity Gel
存储缓冲液
Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.
Buffer: PBS with 0.02% sodium azide,50% glycerol,pH7.3.
纯化方式
Affinity purification

抗原信息

免疫原
A synthetic peptide corresponding to DDDDK tag.
序列
DYKDDDDK
进行序列比对

用户验证的应用

应用及物种
  • Co-IP (Stemphylium eturmiunum)

背景信息

FLAG-tag, or FLAG octapeptide, or FLAG epitope, is a polypeptide protein tag that can be added to a protein using recombinant DNA technology, having the sequence motif DYKDDDDK. It has been used for studying proteins in living cells and for protein purification by affinity chromatography. It has been used to separate recombinant, overexpressed protein from wild-type protein expressed by the host organism. It can also be used in the isolation of protein complexes with multiple subunits, because its mild purification procedure tends not to disrupt such complexes. It has been used to obtain proteins of sufficient purity and quality to carry out 3D structure determination by x-ray crystallography.A FLAG-tag can be used in many different assays that require recognition by an antibody. If there is no antibody against a given protein, adding a FLAG-tag to a protein allows the protein to be studied with an antibody against the FLAG sequence. Examples are cellular localization studies by immunofluorescence or detection by SDS PAGE protein electrophoresis and Western blotting.

RRID
AB_2863789
别名
DDDDK;DDDDK tag;DDDDK-tag

FAQ

折叠内容

ABclonal公司的抗体，可以回收利用几次？

首先，一般抗体不推荐客户回收利用，抗体使用之后缓冲体系已经发生改变，不同客户在回收抗体的保存条件上也会有差异，所以抗体回收使用效果无法保证。另外，ABclonal公司也做过一批抗体回收验证测试，测试结果显示不同抗体可回收次数不同，一般效价越高的抗体，可重复使用的次数越多，客户可根据实验情况来确定。
注：我们将孵育完毕后剩余的抗体回收到离心管中置于4℃保存，效价高的抗体可至少保存1周，至少重复利用3次。

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ABclonal作为国产抗体品牌的优势？

武汉爱博泰克生物（ABclonal）科技有限公司是国产品牌，她成立于2011年，公司依托ABclonal美国波士顿抗体与蛋白研发中心、中国光谷生物城(武汉)抗体生产基地以及上海张江分子酶研发中心，凝聚了十余位来自哈佛大学、麻省理工、复旦大学、上海交大、中科院生化细胞所和武汉大学的全球知名分子和免疫学方面博士，组成我们的科学家团队，通过聚焦抗体与酶核心技术，致力于打破国际技术的垄断，将公司打造成为科研工具和诊断原料的国内领导品牌，乃至弯道超越国际巨头。 我们拥有包括兔多克隆抗体、小鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体的生产研发平台，同时也有包括WB,IHC,IF,IP,CHIP在内的检测平台，我们对每一支自产的抗体进行了严格的检测。当然，我们部分直销地区也可以帮客户代购进口品牌的产品。同时也有抗体定制服务。ABclonal抗体优势：1，严自检，保质量；2产品多，指标全；3，价格低，货期短。注：ABclonal抗体价格体系详情见附件

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ABclonal抗体成分？

ABclonal抗体成分在平时工作当中，常会有客户咨询我们的抗体用的什么buffer进行保存，一般来说，我们的buffer的成分是：PBS含0.03%的proclin300、0.05%牛血清白蛋白、50%甘油；也有一些是PBS含0.03%的proclin300，50%甘油。防腐剂 Proclin 300活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MCI）和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMCI）。ProClin生物灭活剂能够迅速穿透细胞膜，抑制对细胞呼吸至关重要的特定酶，因此一接触微生物有机体就会立即抑制细胞活性。ProClin的多个特定毒性位点可以防止微生物产生高水平的耐药性。

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实验方案

折叠内容
IP

IP检测（琼脂糖偶联磁珠、亲和凝胶偶联磁珠）

一、实验试剂

  • （1）Agarose Beads,or Affinity Gel
  • （2）裂解液&洗杂液：Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)（RM00022）
  • （3）蛋白酶抑制剂(RM02916)
  • （4）1×PBS 缓冲液(RM00012)
  • （5）5×loding buffer（RM00001）（使用时用去离子水稀释至工作浓度即可）
  • （6）洗脱液：0.1-0.2M甘氨酸，pH:2.5-3.1
  • （7）中和液：1M Tris-base pH:10.4

二、实验步骤

1、样本处理

（1）贴壁培养细胞

  • a. 去除贴壁细胞的培养液，用PBS或无血清培养基清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
  • b. 107细胞加入1ml Cell lysis buffer for IP（已加入蛋白酶抑制剂）,移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。2-8℃旋转15min，20转/min。
  • c. 低温下超声1min。
  • d. 14000g，4℃离心10min，小心吸取上清。

（2）悬浮培养细胞

  • a. 低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
  • b. 107细胞加入1ml Cell lysis buffer for IP（已加入蛋白酶抑制剂），移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。2-8℃旋转15min，20转/min，充分裂解后应无明显沉淀。
  • c. 低温下超声1min。
  • d. 14000g，4℃离心10min，小心吸取上清。

（3）组织样本

  • a. 把组织剪切成细小的碎片。
  • b. 取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解,按照每100-200mg组织加入1ml Cell lysis buffer for IP（已加入蛋白酶抑制剂）。
  • c. 4℃旋转混匀裂解15min。
    （步骤b，c也可采用以下过程：每100-200mg组织加入1ml Cell lysis buffer for IP（已加入蛋白酶抑制剂）。低温下用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。）
  • d. 低温下超声2min。
  • e. 14000g，4℃离心10min，小心吸取上清
2、Beads预处理
  • （1）将 Agarose Beads,or Affinity Gel颠倒或漩涡混匀（溶液无分层）。
  • （2）取30-40μl Agarose Beads,or Affinity Gel至新的EP管中，加入500ul 预冷的Cell lysis buffer for IP,4℃、1200g离心2分钟，去掉上清，重复2次，共洗涤3次，。
3、结合蛋白
  • （1）将含有抗原的样品（通常300μl，总蛋白200-500μg或者纯化后蛋白20μg左右）加入已处理好的Agarose Beads,or Affinity Gel中，置于翻转混合仪4℃下反应2h或过夜。
  • （2）将上述完成孵育的复合物，4℃、1200g离心2分钟，弃上清。
  • （3）加入500ul预冷的 Cell lysis buffer for IP (已加入蛋白酶抑制剂),4℃、1200g离心2分钟，去掉上清，重复3次，共洗涤4次。
4、抗原洗脱

（1）变性洗脱

此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。

  • a. Agarose Beads,or Affinity Gel去除上清后，向其中加入35μl 1X SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，95℃加热10min。
  • b. 1200g离心2分钟，收集上清液进行SDS-PAGE检测。

（2）非变性洗脱

  • a. Agarose Beads,or Affinity Gel除上清后，加入50μl洗脱液，混合均匀，室温孵育5min。
  • b. 1200g离心2分钟，收集上清液至新的EP管中。
  • c. 加入中和液中和至pH7.0-8.0。用于后期功能分析。
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