可以将5 kb的片段组装入15 kb的载体中，总长度高达20 kb。

一次反应可以组装的DNA片段数量依赖于片段的长度和序列。MultiF Seamless Assembly已经被证明可以成功将12个0.4 kb片段一次性插入载体中。但是我们推荐一次反应不要超过5个插入片段，以保证插入片段正确组装产生阳性克隆。 若多个片段一次反应组装失败，我们建议分成几步组装，降低单次反应的组装片段数量。

当使用12 bp同源序列时，能够得到高效的组装结果，但是这依赖于同源序列的GC含量。我们推荐使用16 bp或更长的同源序列，同源序列的 Tm > 48°C （AT pair = 2°C and GC pair = 4°C）。

MultiF Seamless Assembly Mix 中的外切酶活性是针对≤100 bp的同源序列长度优化的。

可以。当片段大小≤200 bp时，为了更佳的效果，推荐插入片段使用量为载体的五倍以上。

可以。当组装2-3个片段时，15分钟的反应时间已经足够。当组装4-6个片段时，推荐60分钟的反应时间。通常情况下不推荐反应时间小于15分钟。在某些情况下，更长的反应时间可能适当的提高组装效率，但是不能超过4小时。切勿使用 MultiF Seamless Assembly反应过夜。

在50°C反应时最佳，但是在40-50°C也能工作。

不可以，在His-tag重复密码子后，必须加上与His-tag重复密码子不同的至少3个碱基，并且在同源序列末端要避免重复序列。

两者最主要的区别在于两个相邻片段间的同源序列的长度和组装反应的孵育时间。带15–25 nt 同源序列的 2-3个片段组装，我们推荐用15分钟的反应时间。带20–80 nt 同源序列的大于6个片段组装，我们推荐60分钟的反应时间。4-6个片段所需的DNA总量也要高于2–3个片段。

可以。组装好的产物是完整的序列，可以用做后续的PCR扩增。若最终的产物是个闭合的环形DNA分子，那么MultiF Seamless Assembly产物也可以作为rolling-circle amplification (RCA)的模板。

可以。但是要优化好每条寡核苷酸加入的量。我们推荐每条寡核苷酸起始使用浓度为45 nM。