ChIP-SeQ

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服务介绍

ABclonal 作为科研抗体领域的专业品牌，致力于修饰性抗体的研发。我们经过多年的努力，已经成功研制出了上千种修饰性抗体，并且建立了强大的抗体检测平台，包括 WB、IHC、IF、IP、RIP、ChIP 、ChIP-Seq、shRNA靶点敲除验证等多元化检测手段。我们竭诚为客户提供全面并且可靠的抗体产品。
依托于 ABclonal 抗体库中高质量 ChIP 级别的抗体，结合高通量测序技术，我们推出了ChIP-Seq 特色服务品牌 Omicgene。我们主要技术团队在表观遗传学领域有丰富的研发经验，自品牌建立以来已立项近千个。目前，我们是国内少有的能够提供 ChIP 实验、ChIP-qPCR 检测、高通量测序文库构建、生物信息学数据分析全套服务的技术外包服务团队。

ChIP-Seq 原理

  • 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)技术主要是用于研究 DNA 和蛋白质的相互作用。染色质主要是由组蛋白和缠绕在上面的 DNA 组成。在染色质上还结合了许多转录因子、染色质重塑相关蛋白和非编码 RNA。染色质上结合的蛋白或者组蛋白上不同的共价修饰可以通过改变染色质的结构，或者招募相关的因子来调控基因的表达。通过 ChIP 技术，我们可以研究不同的组蛋白修饰、转录因子以及染色质上结合的一些其他蛋白，在基因组上的分布。
  • ChIP 实验的主要原理是，当 DNA 和蛋白结合或者距离很近时，通过甲醛固定交联，在 DNA 和蛋白分子之间形成共价键。将染色质通过超声波破碎或者微球菌核酸酶处理，打断成小片段，然后通过特异性的 ChIP 级别抗体，富集目的蛋白。经过逆交联处理之后，消化水解目的蛋白，回收得到目的 DNA，从而得到与目的蛋白相互作用的 DNA 信息。
  • ChIP-Seq 技术是将传统的 ChIP 实验与高通量测序技术结合，对 ChIP 实验富集得到的目的 DNA 进行高通量测序分析，得到全基因范围目的蛋白结合的序列信息和位置信息。

技术优势

  • 全面的 ChIP 级别抗体库
  • 经验丰富的实验团队
  • 专业的数据分析团队
  • 多组学联合、个性化分析
  • 依托于武汉大学的技术团队

技术路线

样本要求

  • 动物细胞：3x107 ~ 5x107，1%的甲醛交联，干冰运输。
  • 动物组织：0.5-2g，对于较大的组织，先切成1-5mm的组织块，干冰运输。
  • 植物组织：5-20g，干冰运输。
  • 抗体需要提前验证满足ChIP或者IP实验要求。

分析内容

  • 测序原始数据质控
  • 低质量数据的过滤
  • 测序数据比对参考基因组
  • ChIP-Seq 富集峰的查找（peaks calling）
  • ChIP-Seq 富集峰在基因组功能原件的分布
  • 目的蛋白靶基因的查找
  • 目的蛋白靶基因功能分析和通路分析
  • 目的蛋白结合的 motif 的查找
  • 不同样本之间差异富集区域的分析
  • 不同样本之间差异富集区域的靶基因和相关功能分析
  • 多组学联合的个性化分析

服务周期

ChIP-qPCR

10-15个工作日

ChIP-Seq

45-70个工作日

文库构建

5-10个工作日

高通量测序

20-30个工作日

数据分析

10-15个工作日

案例分析

案例1

背景介绍

  • 水稻作为主要的粮食作物，如何增加水稻的产量一直以来都是非常具有挑战性的工作。在本研究中，来自于武汉大学的研究团队发现，在水稻中通过抑制小干扰RNA miR396可以显著的提高水稻的产量。研究人员发现miR396可以抑制水稻生长调控因子OsGRF6的表达。通过miR396类似物抑制miR396的活性，OsGRF6的表达量增加，同时水稻的产量增加。过表达OsGRF6也可以显著提高水稻的产量。进一步研究人员通过ChIP-Seq的方法，分析了OsGRF6全基因组的分布，找到200多个OsGRF6结合位点，OsGRF6结合的靶基因主要与生长素合成和花穗生长相关。这项研究为水稻增产提供了新的思路。

案例2

背景介绍

  • 组蛋白H3K36me3修饰主要和基因表达活化相关。H3K36me3主要分布在活跃转录基因的基因本体上，与mRNA的可变剪接相关，H3K36me3还参与了DNA损伤修复过程。SETD2是主要的H3K36me3甲基转移酶，研究人员发现CUL3泛素E3连接酶复合物亚基SPOP可以和SETD2相互作用，降解SETD2。在该研究中，研究者通过全基因组ChIP-Seq 和 RNA-Seq的方法，发现SPOP可以通过调控SETD2的稳定性，影响H3K36me3的分布，从而调控mRNA的可变剪接。

注意事项

注意事项

起始细胞量在5*10e6以上，如果细胞量太少，ChIP富集得到的量很少，不一定能满足后续的实验要求。细胞量也不宜过多，细胞量太多会影响染色质打断的效果。我们推荐超声破碎时细胞密度不要高于1*10e7/mL。也可以通过超声破碎之后chromatin的量来定量。一般做组蛋白和组蛋白修饰的ChIP，chromatin量在7-10ug；对于结合位点比较多的转录因子，chromatin的量在15-20ug；对于结合位点很少的转录因子和蛋白，推荐使用20-30ug chromatin 进行IP实验。
甲醛对人体有害，操作最好在通风厨中进行。甲醛交联的终浓度为1%，时间一般为10-15min。交联的时间过长会影响超声破碎的效果。一般培养细胞交联10min，组织样品交联15min。交联之后立即用终浓度125mM的甘氨酸中和甲醛，终止交联。交联时间延长会影响染色质打断的效果，也会增加蛋白和DNA非特异性的结合。
不同的细胞和组织，超声破碎的条件不太一样，如果处理的细胞之前没有做过ChIP实验，不知道超声条件的，在正式实验之前，需要摸索超声破碎的条件。超声破碎处理时间不宜过长，时间过长会影响蛋白和DNA的结合，也可能会破坏蛋白的结构，影响ChIP实验富集的效果。超声打断时间太短会导致染色质片段偏大，PCR扩增过程中引入背景信号。
ChIP 实验对抗体要求很高，需要抗体的特异性和亲和性都很强。如果抗体的特异性不好，最终IP富集到很多非特异性的DNA序列。如果抗体的亲和性不好，最终富集到的DNA量会很少。由于ChIP实验过程中会使用甲醛交联处理，会导致蛋白的结构发生变化，普通能做WB和IP的抗体，不一定能满足ChIP的实验要求。在正式的ChIP实验之前，最好提前验证抗体是否满足ChIP或者IP级别。
抗体的量可以根据超声破碎之后chromatin的量来确定。我们推荐10ug的chromatin加入3-5ug的ChIP级别抗体。抗体量太少最终富集的DNA浓度偏低，抗体过多会增加背景。
ChIP实验结果的检测需要设计阴性和阳性引物进行PCR扩增。ChIP引物的设计非常关键。如果引物设计有问题，很可能导致ChIP实验成功了，但是检测结果是假阴性的，也可能发生ChIP 实验失败了，但是检测结果是假阳性的。
ChIP 靶基因的选择可以参考已经发表的文章，另外像ENCODE和roadmap等项目已经做过很多组蛋白修饰和转录因子的ChIP-Seq实验，也可以从这些已经发表的数据中查找目的蛋白结合区域和靶基因。
要做好ChIP-Seq，满足要求的抗体是至关重要的，一般客户选择文献中报道的抗体来做实验，但是抗体有运输和批次间差异问题，所以很多时候买到的抗体大部分是不满足该实验要求的，ABclonal整合了全球的ChIP-Seq抗体资源，每种抗体都大包装备有库存，来解决客户遇到的最棘手的问题。
染色质的打断和高特异性的抗体是ChIP-Seq实验的关键。ChIP-Seq对DNA片段的要求一般为200-800bp，DNA的打断可以通过酶切或者超声破碎的方法。对于不同用量的细胞或者组织样品，通常需要摸索最适的酶切或者超声破碎条件。抗体主要依赖其高亲和力和高特异性，且商业化抗体选择有非常多的经验讲究。
主要集中在组蛋白修饰位点、表观遗传因子和转录因子等能够和DNA结合的靶点蛋白。
交联细胞（优先）：3X107，需甲醛、甘氨酸等处理，保留细胞沉淀，干冰运输。
具体操作：
A、收获细胞：收集3~5X107细胞，即最少用1个10cm dish 培养皿的细胞。
交联：在室温下，加入终浓度为1%的甲醛（具体体积根据培养皿中的培养基的量进行计算，我们用的是国药初始浓度为37%左右的产品，直接在培养基中加入即可），混匀，交联小幅摇晃10min；注：交联程度过低则不能有效得到蛋白质-DNA复合物，交联程度过高则很难打断DNA。然后加入终浓度为0.125M的甘氨酸（起始浓度为2.5M，用蒸馏水配置），混匀后，静置5min；注：培养基颜色会变黄。
离心收集：对于悬浮细胞，直接3000rpm 离心1-2min收集细胞，然后PBS清洗3次（加入1ml 1X PBS(pH 7.4)洗细胞后3000rpm离心1-2min，去上清。）；对于贴壁细胞，使用细胞刮刀将细胞刮下，收集到EP管中，1X PBS (pH 7.4)清洗2-3次。去上清后，将细胞冻存在-80℃冰箱，运输时使用干冰运输。
B、活细胞：1X106细胞放入培养瓶，装满培养基后常温运输。
准备指数生长期细胞，尽量不要让细胞太满，否则容易脱落，运输前给细胞换液，培养液装满培养瓶（瓶口、瓶盖多在酒精灯上烧烧，一般不会污染），封口胶密封。棉花裹紧，放在泡沫盒里即可。
C、动物组织样品：0.5-2g组织样品，通过干冰运输。对于较大的组织需要先切成1-5mm的组织块。
D、植物组织：5-20g。
RNA-Seq要求与ChIP相同。将组织和细胞放Trizol裂解液中，干冰运输。
不同DNA结合蛋白或者组蛋白修饰在基因组上的分布差异很大，因此通过ChIP-Seq对这些DNA结合蛋白或者组蛋白修饰进行研究对测序数据量的要求也有很大的差异。转录因子等反式作用因子的测序数据量要求10-20M reads数目，组蛋白修饰测序数据量要求20-40M reads数目。
ABclonal ChIP-Seq数据分析包括基本分析和个性化分析。基本分析包括测序数据的质量控制，测序数据比对到基因组上，ChIP-Seq数据在全基因上的不同区域分布趋势，ChIP-Seq富集peaks的查找，ChIP-Seq peaks区域目的基因的GO功能注释和pathway分析，查找转录因子或者反式作用因子结合的motif。个性化分析我们可以和客户协商，针对不同的研究内容调整分析策略。针对于不同转录因子或者组蛋白修饰在基因组上分布的差异，我们在分析过程中会采取不同的分析策略。
由于ChIP-Seq实验操作过程中涉及到DNA的打断和抗体富集等诸多因素的影响，对照组的选择是至关重要的。ChIP-Seq对照的选择有三种：Input，阳性对照和阴性对照。Input是ChIP实验过程中打断的DNA片段，是不通过抗体富集，直接逆交联再纯化得到DNA。Input对照可以用于检测DNA打断的效果，以及作为背景信号用于后期的ChIP-Seq数据分析，找到目的蛋白在基因组上富集的区域。阳性对照通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体，常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II抗体等。阴性对照通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。
ChIP-Seq技术是在全基因组范围上研究DNA结合蛋白和组蛋白修饰以及核小体的分布情况。相对于ChIP和ChIP-ChIP技术来说，ChIP-Seq灵敏度和分辨率都有很大的提高，而背景相对较低。ChIP-Seq数据可以提供给研究人员大量的信息，目前表观遗传学领域的高水平文章基本都会用到ChIP-Seq的数据。
根据客户实验物种和研究指标，将实验难度分为四个等级：
第一等级：人、大小鼠组蛋白修饰；
第二等级：人、大小鼠外其他动、植物样品组蛋白修饰，人、大小鼠热门转录因子；
第三等级：人、大小鼠外其他动、植物样品热门转录因子，人、大小鼠非热门转录因子；
第四等级：标签类转录因子。