免疫荧光实验成败，一半在于抗体选择。
无论是细胞定位、蛋白表达还是病理切片，一支适配性强、特异性高、荧光信号稳定的抗体，直接决定你的图片能否达标、能否用于文章发表。
面对市面上琳琅满目的抗体，很多人都会陷入选择困难：
怎么挑才不踩坑？
哪些指标最关键？
结合 ABclonal 多年抗体研发与验证经验，我们整理了这份超全免疫荧光抗体选择指南，用2大方法、6个关键点，帮你快速选出适配抗体，轻松拍出高质量 IF 图片！

一、免疫荧光原理及应用
免疫荧光（Immunofluorescence，IF）主要原理是利用荧光标记的抗体作为探针对组织或细胞内特定抗原进行定位和定性分析，由于其具有特异性强、敏感性高、速度快等优点，广泛用于科学研究与临床诊断。

二、免疫荧光标记两大方法
1-直接法免疫荧光标记
将标记有两种不同荧光素的抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，与实验样本一起孵育，之后洗去未与样本结合的荧光抗体，在荧光显微镜观察，即可对两种抗原进行定位和定性。

2-间接法免疫荧光标记
未荧光标记的两种特异性一抗（不同种属来源）按顺序孵育组织或细胞，洗去多余的一抗后，再用两种不同的荧光素分别标记的二抗孵育组织或细胞，洗去多余的二抗，后在荧光显微镜观察，从而对两种抗原进行定位和定性。

小编从实验时间、复杂性、灵活性、敏感性、种属交叉反应性和背景几方面进行了详细的归纳比较。请看下表：


三、免疫荧光抗体—选择法则
如果只研究两个抗原蛋白在细胞中共定位情况，这种建议选择直标一抗，可以相对减少二抗交叉反应的风险。
但目前实验室中更多的还是用间接法免疫荧光来研究多个目的抗原在细胞中共定位情况，所以我们这期重点介绍间接法免疫荧光怎样挑选抗体。

一抗选择指南
根据实验样本选择一抗
一抗宿主应尽量选择与检测样本不同来源，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应。
例如：检测小鼠样本，则尽量避免选择小鼠或大鼠源的一抗（如果选了同种属一抗建议加个同型对照)，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了不同荧光素的抗兔IgG。

二抗选择指南

根据一抗种属

荧光标记二抗与一抗的种属要匹配，比如一抗是小鼠来源，二抗就选抗小鼠二抗（如山羊抗小鼠）；如果一抗是兔来源，那就选抗兔二抗（如山羊抗兔）

根据抗体类型与亚型

一抗为单克隆抗体：二抗应针对一抗的类型或亚类型。例如，一抗是小鼠IgM则需要选择抗IgM的二抗。当使用多个亚类特异性一抗时，应使用亚类特异性二抗来区分一抗。例如，在使用IgG1和IgG2一抗的免疫荧光双标实验中使用抗IgG1和抗IgG2二抗是更佳的选择。
一抗为多克隆抗体：可以使用IgG二抗，因为大多数多克隆抗体是IgG类免疫球蛋白
根据二抗的类型：胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞等细胞内细胞或组织表达Fc受体较高，全长二抗的Fc端容易与Fc受体结合，选择F(ab)2片段抗体避免非特异性结合。
根据二抗的纯化方式：经交叉吸附处理的二抗在纯化后再次通过固定了其他种属的血清或抗体的纯化柱，降低种属间交叉反应，在多色分析具有突出的优势。
根据荧光基团：目前常用的荧光标记基团有ABflo®系列、FITC、Rhodamine、Texas Red、PE、Cy3等。
多色标记需要综合考虑各靶点表达丰度和各通道信号强度，尽可能让低丰度靶标搭配强荧光，高丰度靶标搭配弱荧光，让二者处于平衡。

四、免疫荧光抗体—经验问答
Q：抗体说明书上面没有写该抗体能够用于IF实验怎么办？
首选就是该抗体必须满足IF应用，所以买抗体要看清楚厂家的说明书，是否满足IF应用，尽量不要抱着试试的心里去尝试，往往只会白浪费大家时间，打击自己的信心，就得不偿失了。

Q：为什么我的抗体做WB非常好，而做不了IF实验？
首先，恭喜你获得一个很好的做WB抗体，毕竟能获得好的WB抗体也不容易呢。
其次，你这个抗体很可能是通过人工合成多肽免疫制备而来，抗体主要识别线性表位，当免疫原序列在天然构象中包埋于蛋白质内部时，抗体仅能在蛋白质变性、线性表位暴露后结合，所以不要有着做WB优秀，做IF就“NO problem”的想法哦！
所以在实验中还是需要注意抗体是否满足该实验以及需要进行一定的实验条件摸索。

Q：WB和IF的二抗是一样的吗？
很明显，不是！偶联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC、Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine等）、生物素、金颗粒。WB实验中的二抗一般是HRP或碱性磷酸酶（AP）等标记的抗体，需借助显色底物（如ECL）通过化学发光法显影。而用于免疫荧光实验的是荧光基团标记的抗体，结果需要紫外线激发并用荧光显微镜观察。

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