传统的二维细胞培养难以还原肺部复杂的三维结构与微环境，在疾病建模和药物筛选中的应用存在明显局限。小鼠肺类器官由成体干细胞、多能干细胞或祖细胞在体外三维培养形成，能够高度模拟肺组织的结构与功能，为肺部疾病研究、药物开发及个性化医疗提供更贴近生理状态的高效平台。

然而，类器官构建对操作细节极为敏感，从样本处理到3D培养，每一步都关乎成败。为此，我们推出一套标准化的小鼠肺类器官制备与操作指南，系统梳理关键技术要点，助力研究人员降低技术门槛，稳定获得高生理相关性的实验结果，为肺部机制研究提供可靠支撑。

原代组织来源类器官构建流程图
（图片来源：Nat Protoc. 2021 Dec;16(12):5739. doi: 10.1038/s41596-021-00494-5）

实验前准备
仪器：生物安全柜、CO2恒温细胞培养箱、水平转子离心机（温度可调）、倒置显微镜、冰箱、冰盒、细胞计数仪、水浴锅
耗材：24孔细胞培养板（TC处理）、10 μL/200 μL/1 mL吸头、1.5 mL/15 mL/50 mL离心管、100 μm细胞筛网、一次性刀片和刀柄，灭菌剪刀/镊子、一次性巴氏滴管、6 cm培养皿
试剂：基质胶、组织消化液、润洗液、DPBS、红细胞裂解液、类器官消化液、类器官冻存液、完全培养基（可自配或者购买完全培养基）

原代组织处理和类器官构建

1. 01：实验前先将基质胶埋入冰上解冻4~6 h，同时取出培养基放置室温平衡15 min。注：与细胞接触的离心管、试管或者枪头需要用润洗液润洗后使用。
2. 02：在洁净工作台中，取小鼠原代肺组织，将样本转移至培养皿中，评估获得的组织是否完全由上皮组成。使用灭菌的手术剪刀或手术刀和镊子去除脂肪和肌肉组织，以及组织表面坏死、纤维化或凝结血块杂质。
3. 03：转移到新的15 mL离心管，加入5~8 mL DPBS，使用涡旋仪震荡3~6 s，去除干净清洗液，重复3~5次，至清洗液澄清。注：每次清洗后的上清液应去除干净，避免污染源残留。
4. 04：使用镊子将组织转移至1.5 mL离心管中，加入200 μL组织消化液，用灭菌的剪刀将组织剪碎为0.5~2 mm2大小。注：组织剪碎大小，吸取后不堵1 mL枪头为佳；如组织过大，可选取质地较好的部分，剪碎用时应控制在10 min以内。也可选择刀柄+一次行刀片进行组织切碎处理。
5. 05：将剪碎的组织用8 mL组织消化液重悬，并转移至15 mL离心管内，吹打重悬组织块。用胶带水平固定在37℃，100 rpm条件下的恒温摇床上，消化15-40 min，每隔10 min观察组织消化情况，待组织块明显分散，悬液较浑浊时，取适量组织消化悬液镜检，待大部分组织块呈现絮状、或悬液中有较多组织细胞团，即到达消化终点，直接离心去上清，若组织碎块较大或消化不完全可适当延长消化时间。
6. 06：4℃ 250 g离心3 min，弃上清，加入DPBS重悬，使用润洗过的一次性巴氏滴管吹打组织沉淀10~20次充分释放组织中的细胞，使用100 μm细胞过滤器过滤，DPBS冲洗滤膜残留细胞。
7. 07：收集滤液并在4℃下以250 g离心3 min。在可见的红色沉淀的情况下，吸弃上清液，加入2 mL红细胞裂解液重悬沉淀，在室温下裂解红细胞2 min，加入2倍以上体积DPBS终止裂红，4℃ 250 g离心3 min。注：如红细胞过多，可增加裂解时间，同时手动摇晃离心管加速裂解过程
8. 08：吸弃上清液并将沉淀重悬于DPBS，取样细胞计数*，4℃ 250 g离心3 min。
9. 09：吸弃上清液，大约50000~100000个活细胞应接种在50 μL基质胶中（注意细胞活率过低时，按照总细胞密度100000进行接种），使用预冷的润洗液润洗枪头，加入基质胶（>70%）并在冰上混匀，混匀吹打的动作要轻柔，切忌产生大量气泡，常温混匀则需要控制在15 s内，混匀后及时置于冰上，做好温度控制。注：基质胶应保存在冰上以防止其凝固，基质胶比例应>70%（基质胶体积/总体积）），比例过低会导致基质胶液化无法凝固，以及后续培养过程中因基质胶结构不稳固而散开。
10. 10：将基质胶和细胞的混合悬液点入培养孔板底部正中央，注意避免悬液接触孔板侧壁。（推荐：96孔板接种3~10 μL/孔，48孔板接种10~20 μL/孔，24孔板接种30~50 μL/孔）。注：96孔板、48孔板点胶较为困难，可倾斜孔板点胶；基质胶粘稠，小于10 μL胶滴容易造成误差，注意进行药敏检测时，孔间操作一致性。
11. 11：将培养板放入37℃和5% CO2的培养箱中20-30 min，待基质胶凝固。
12. 12：待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入室温平衡的类器官完全培养基，避免破坏已凝固结构。（推荐：96孔板加入100 μL/孔，48孔板加入250 μL/孔，24孔板加入500 μL/孔）。注：培养基请注意沿壁缓慢加入，避开凝固的胶滴，以免破坏结构；培养基应恢复至室温，避免过冷导致基质胶重新液化或结构不稳定。
13. 13：将培养板置于37 ℃和5% CO2的恒温培养箱中。
14. 14：每隔2~3天更换一次培养基，小心地从孔中吸出培养基，并加入新鲜的室温平衡的类器官完全培养基。
15. 15：密切监测类器官生长状态，理想情况下，类器官应在3-14天内建成。

类器官鉴定
显微镜下观察小鼠肺类器官的形态，并检测相关标记物E-Cadherin、AQP5、CD49F标记物的表达。

小鼠肺类器官培养每日细胞形态变化图

超多重荧光（Cat.RK50080）鉴定小鼠肺类器官相关标志物E-Cadherin(Cat.A20798)、AQP5（Cat.A23292)、CD49F(Cat.A26707)的表达

小鼠肺类器官技术作为连接基础研究与临床应用的重要桥梁，正以其独特的优势革新我们对呼吸系统疾病的理解与治疗策略。它不仅为肺部发育、损伤修复及病原体感染机制研究提供了高度仿生的研究模型，也为药物筛选和毒性评估开辟了新路径。基于此，ABclonal 开发了一系列高品质的类器官相关产品，助力小鼠肺类器官培养及相关前沿研究。

ABclonal相关全流程试剂产品列表