条带呈笑脸状
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凝胶不均匀冷却,电泳时中间比两侧更热
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降低电泳时的电压
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条带呈皱眉状
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凝胶和玻璃挡板底部有气泡;两遍聚合不完全
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电泳槽中加电泳液时排空玻璃挡板下方的气泡;配胶时充分混匀
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拖尾
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样本中蛋白溶解不好
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上样前对样本煮沸5min,离心1min
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出现纹理(纵向条纹)
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样本中含有不溶性颗粒
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上样前对样本煮沸5min,离心1min
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条带偏斜
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电极不平衡或者加样位置偏斜;凝胶不均匀凝固
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在未加样孔中加入等量样品缓冲液,配胶时充分混匀
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条带弥散
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上样时样品被电泳缓冲液稀释;浓缩胶配制出错或梳齿底部过短
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上样时自底部往上缓缓加样;使用新配制AP,按照配方配浓缩胶;梳齿底部至分离胶顶约1.0~1.5cm
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条带宽窄不均
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蛋白浓度不同,上样时体积差异过大
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浓度高的样本中补充1*上样缓冲液至各样本体积大致相同
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没有阳性条带
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一抗或二抗失效
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更换抗体,选择现配现用工作液
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一抗/二抗不匹配
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更改为同种属及同亚型的抗体底物
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发光液失效
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更换新的发光液
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标本中不含目的蛋白或目的蛋白含量太低
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设置阳性对照,确定样本中是否含靶蛋白;增加标本上样量解决靶蛋白含量低
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抗体染色不充分
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增加抗体浓度;延长孵育时间
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溶液中有辣根过氧化酶抑制剂
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所有溶液和器皿中避免含有叠氮化钠
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抗体活性降低
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选择在有效期内的抗体;工作液现配现用,避免长时间放置
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有阳性条带,但条带比较弱
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样本中目的蛋白含量太低
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增加标本上样量
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洗膜过度
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缩短洗涤时间 |
曝光时间过短 |
延长曝光时间 |
封闭过度 |
减少封闭剂的量或缩短时间;换用不同封闭剂类型 |
蛋白转移不充分 |
优化转膜条件;调整转膜时间;严格按照配方配制转膜液体;如为PVDF膜,需提前用100%甲醛浸泡
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背景高 |
洗膜不充分 |
增加洗液体积和洗涤次数;洗涤液中加入Tween-20 |
二抗浓度过高 |
降低二抗浓度 |
二抗的非特异性背景 |
不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否由二抗系统来源;重新选择二抗
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封闭不充分 |
增加封闭液孵育时间,或者提高温度。选择合适的封闭试剂 |
抗体与封闭蛋白有交叉反应 |
更换封闭剂;洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应 |
曝光过度 检测过程中膜干燥
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缩短曝光时间 保证充分的反应液,避免出现干膜现象
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非特异性条带(多条带)
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抗体浓度过高 |
降低抗体(一抗、二抗)浓度 |
一抗的特异性不够 |
使用单克隆或者亲和纯化的抗体,保证抗体的特异性 |
二抗的非特异性结合 |
不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否由二抗系统来源;重新选择二抗
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蛋白上样量过大 |
降低上样量 |
蛋白降解 |
避免反复冻融;使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂 |
不同剪切体存在 |
分析不同剪切体的大小并核对 |
细胞传代过多,导致蛋白变异 |
使用原代或传代少的细胞作对照 |
背景有不均匀白色斑点 |
转膜过程中有气泡存在 |
仔细检查,避免存在气泡 |
抗体分布不均匀 |
孵育抗体时使用摇床 |