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Western blot analysis of various lysates, using [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665) at 1:1000 dilution.293T, C6 and NIH/3T3 cells were treated by Chloroquine (50 μM) at 37℃ for 20 hours.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25μg per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 5s.

Western blot analysis of lysates from wild type(WT) and LKB1 knockout (KO) 293T cells, using [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665) at 1:1000 dilution.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25μg per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 30s.

Immunohistochemistry analysis of LC3B in paraffin-embedded human brain using [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665) at dilution of 1:100(40x lens).Perform high pressure antigen retrieval with 10 mM citrate buffer pH 6.0 before commencing with IHC staining protocol.

Immunohistochemistry analysis of LC3B in paraffin-embedded rat brain using [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665) at dilution of 1:100(40x lens).Perform high pressure antigen retrieval with 10 mM citrate buffer pH 6.0 before commencing with IHC staining protocol.

Confocal imaging of HeLa cells (treated with chloroquine) and HeLa cells (untreated) using [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665,dilution 1:100) (Red). DAPI was used for nuclear staining (blue). Objective: 100x.

Immunoprecipitation analysis of 300 μg extracts from 293T cells using 3 μg LC3B antibody (A19665). Western blot was performed from the immunoprecipitate using LC3B antibody (A19665) at a dilution of 1:1000.

All(6)|
货号: A19665
促销价:   ¥1400
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文献引用 (96)

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客户数据及评论 (3)

折叠内容
CustomerSep 282023
评分
Experiment Type
IF
Sample
Hela
Description
Immunofluorescence analysis of Hela cells, using LC3B monoclonal antibody at 1:100 dilution
CustomerSep 222023
评分
Experiment Type
WB
Sample
Hela
Description
Western blot analysis of extracts of Hela cells,using LC3B Rabbit mAb at 1:1000 dilution.
CustomerSep 112019
评分
Experiment Type
WB
Sample
Chicken
Description
Exposure:7s

详细信息

推荐稀释比
  • WB1:500 - 1:1000
  • IHC-P1:50 - 1:200
  • IF/ICC1:50 - 1:200
  • IP0.5μg-4μg antibody for 200μg-400μg extracts of whole cells
浓度查询

请输入产品标签上的lot号,例如4000000001

反应物种
Human, Mouse, Rat
同种型
IgG
理论分子量
15kDa
实际分子量
14kDa/16kDa
克隆号
ARC0144
产品形式
Liquid
偶联物
Unconjugated
存储缓冲液
Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.
Buffer: PBS with 0.05% proclin300,0.05% BSA,50% glycerol,pH7.3.
阳性样本
293T,C6,NIH/3T3
细胞定位
Cytoplasm,Cytoplasmic vesicle,Endomembrane system,Lipid-anchor,autophagosome,autophagosome membrane,cytoskeleton
纯化方式
Affinity purification

抗原信息

免疫原
Recombinant fusion protein containing a sequence corresponding to amino acids 2-107 of human LC3B (Q9GZQ8).
序列
PSEKTFKQRRTFEQRVEDVRLIREQHPTKIPVIIERYKGEKQLPVLDKTKFLVPDHVNMSELIKIIRRRLQLNANQAFFLLVNGHSMVSVSTPISEVYESEKDEDG

用户验证的应用

应用及物种
  • WB (Homo sapiens , Mus musculus , Gallus gallus , Rattus norvegicus , Mus musculus , Homo sapiens , Sus scrofa , Ctenopharyngodon idellus , Human)
  • IF (Rattus norvegicus , Mus musculus , Homo sapiens , Gallus gallus , Mus musculus , Homo sapiens)
  • IHC (Homo sapiens , Mus musculus , Rattus norvegicus)

背景信息

The product of this gene is a subunit of neuronal microtubule-associated MAP1A and MAP1B proteins, which are involved in microtubule assembly and important for neurogenesis. Studies on the rat homolog implicate a role for this gene in autophagy, a process that involves the bulk degradation of cytoplasmic component.

关联靶点

MAP1LC3B为关键词搜索文献记录,得到上述基因与MAP1LC3B的研究紧密相关,排序顺序根据研究相关程度由高到低决定。(所显示数字代表两者共同出现的已发表文献数量)
1/

关联领域

MAP1LC3B为关键词搜索文献记录,得到上述相关热词信息,可反映出MAP1LC3B的研究趋势与热点。(关联领域与基因名称的距离代表其研究热度)

* 该数据来源于赛特新思(citexs.com)
来自于发表文献,仅供参考所用,ABclonal不承担任何责任。

暂无以MAP1LC3B为关键词搜索的文献记录。

该服务由赛特新思提供,上述关联分析来自已发表文献,仅供参考所用,ABclonal不承担任何责任。

ABclonal公司的抗体,可以回收利用几次?

首先,一般抗体不推荐客户回收利用,抗体使用之后缓冲体系已经发生改变,不同客户在回收抗体的保存条件上也会有差异,所以抗体回收使用效果无法保证。另外,ABclonal公司也做过一批抗体回收验证测试,测试结果显示不同抗体可回收次数不同,一般效价越高的抗体,可重复使用的次数越多,客户可根据实验情况来确定。
注:我们将孵育完毕后剩余的抗体回收到离心管中置于4℃保存,效价高的抗体可至少保存1周,至少重复利用3次。

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ABclonal作为国产抗体品牌的优势?

武汉爱博泰克生物(ABclonal)科技有限公司是国产品牌,她成立于2011年,公司依托ABclonal美国波士顿抗体与蛋白研发中心、中国光谷生物城(武汉)抗体生产基地以及上海张江分子酶研发中心,凝聚了十余位来自哈佛大学、麻省理工、复旦大学、上海交大、中科院生化细胞所和武汉大学的全球知名分子和免疫学方面博士,组成我们的科学家团队,通过聚焦抗体与酶核心技术,致力于打破国际技术的垄断,将公司打造成为科研工具和诊断原料的国内领导品牌,乃至弯道超越国际巨头。 我们拥有包括兔多克隆抗体、小鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体的生产研发平台,同时也有包括WB,IHC,IF,IP,CHIP在内的检测平台,我们对每一支自产的抗体进行了严格的检测。当然,我们部分直销地区也可以帮客户代购进口品牌的产品。同时也有抗体定制服务。ABclonal抗体优势:1,严自检,保质量;2产品多,指标全;3,价格低,货期短。注:ABclonal抗体价格体系详情见附件

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ABclonal抗体成分?

ABclonal抗体成分在平时工作当中,常会有客户咨询我们的抗体用的什么buffer进行保存,一般来说,我们的buffer的成分是:PBS含0.03%的proclin300、0.05%牛血清白蛋白、50%甘油;也有一些是PBS含0.03%的proclin300,50%甘油。防腐剂 Proclin 300活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)。ProClin生物灭活剂能够迅速穿透细胞膜,抑制对细胞呼吸至关重要的特定酶,因此一接触微生物有机体就会立即抑制细胞活性。ProClin的多个特定毒性位点可以防止微生物产生高水平的耐药性。

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实验方案

折叠内容
WB

蛋白免疫印迹实验步骤

一、实验仪器及试剂

1、样品制备试剂
  • a. RIPA 裂解液
  • b. 蛋白酶抑制剂
  • c. BCA工作液
  • d. BSA Standard Solution(5mg/ml)(RM00005)
  • e. 1×PBS缓冲液(RM00012)
  • f. 5×loading buffer(RM00001)
2、制胶试剂
  • a.30% Acr-Bis (29:1)(RM00006)
  • b.1 M Tris-HCl (pH6.8)(RM00003)
  • C.1.5M Tris-HCl (pH8.8)(RM00002)
  • d.10% SDS(RM00004)
  • e.10% Ammonium persulfate (APS)(RM00007)
  • f.TEMED(RM00009)
3、电泳、转膜试剂及耗材
  • a. 1X Tris-Glycine SDS Running Buffer(RM00010)
  • b. 1X Western Transfer Buffer(RM00011)
  • c. Filter Paper (7.5×10cm)(RM00019)
  • d. Nitrocellulose membrane(RM00017/ RM02801/ RM00018)
4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂
  • a. 1XTBST Buffer(RM00013)
  • b. 1X Western Blocking Buffer(RK05742)
  • c. Skimmed milk powder(RM00014)
  • d. Bovine Serum Albumin (BSA)(RM02802)
  • e. Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)
  • f. HRP 偶联二抗(根据一抗情况选用,AS014/AS003等可供选择)
  • g. SignalFire™ ECL Reagent(RM00020/RM00021)

二、实验步骤

1、样品制备

(1)细胞收集

  • a. 贴壁培养细胞收集
    用细胞刮刮下细胞或用胰酶消化处理后,400×g,离心5 min,弃上清;用适量冰PBS溶液将离心后细胞沉淀重悬,4℃,400×g 离心5min,弃上清,重复清洗步骤一次收集细胞沉淀。
  • b. 悬浮培养细胞收集
    收集悬浮细胞,400×g离心5min,弃上清,适量冰PBS溶液将离心后细胞沉淀重悬,4℃,400×g 离心5min,弃上清,重复清洗步骤一次,收集细胞沉淀。
  • c. 组织样本收集
    把组织在预冷的表面上剪切成细小碎块,然后用液氮或超低温冰箱中冷冻组织30min以上,迅速加液氮研磨,研磨过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。

(2)总蛋白提取

  • a. 细胞/组织裂解:
    根据收集的细胞数量、细胞种类添加适量的裂解液。
    例如常规细胞沉淀可按照1mL裂解液/107个细胞的比例加入相应体积的裂解液,加入裂解液后将沉淀吹打混匀。使用细胞破碎仪超声样本,每次超声时间4-5s,间隔时间在5s左右,肉眼观察,样本为均一,不粘稠液体即可。或采用震荡裂解方式进行,每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s,裂解20min。
    组织碎片可按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液,每3min研磨一次,重复5次,使组织尽量碾碎(裂解液中根据需要添加或不添加蛋白酶抑制剂)。所有理解过程,务必在低温条件下进行。
  • b. 离心:
    把裂解好的样品配平后,将裂解好的样本置于预冷的高速冷冻离心机中,13000×g离心10min,收集上清
  • c. 蛋白变性:
    吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入对应体积的5× Loading Buffer(最终工作液为1×),待干式恒温器温度升至95℃后,将1.5mL离心管插入加热孔中,95℃加热变性10min,待液体完全冷却后置于-20℃保存。

(3)蛋白浓度测定(BCA法)

  • a. BCA工作液的配置
    根据样品数量,按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B(50:1)配置适量BCA工作液,充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。
  • b. BSA标准品梯度稀释
    取10μl蛋白标准品(5 mg/mL BSA)稀释至50μl,使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1×PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中,加稀释液补足到20μl。
  • c. 样本浓度测定
    加适当体积样品到96孔板的样品孔中,如果样本不足20μl,需加稀释液补足到20μl。每孔加入 200μl BCA工作液,37℃放置20-30min。用酶标仪测定样本和标准品在562nm下的吸光度,或在540-595nm之间波长下的吸光度。根据BSA蛋白浓度标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
2、凝胶电泳

(1)制胶器安装

  • 根据使用说明书安装。

(2)凝胶配置

  • 根据目标蛋白大小,选择不同合适浓度的分离胶(见附表)。注意该过程注意不能有气泡产生。

(3)上样

  • 待胶凝固好后,用移液器吸取样品垂直梳孔上样,建议总蛋白上样量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满,外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm即可。

(4)电泳

  • 上样完成后,连通电泳仪电源,注意正负极需连接正确,设定适宜的电泳参数。建议浓缩胶电泳参数为恒压80V,分离胶采用恒压120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时,停止电泳,关闭电泳仪电源。
3、转膜

(1)准备工作

  • a. 转膜缓冲液可提前2h (即开始电泳后)放入-20℃冰箱预冷。
  • b. 根据胶的面积大小,将滤纸以及NC膜剪裁至合适尺寸。
  • c. 建议目的蛋白大于20KD可选择0.45μm NC膜;目的蛋白小于20KD可选择0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜。选择完毕后将膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用。注意使用PVDF膜需先放入甲醇中浸泡1min左右至均匀浸透,没有白点即可放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

(2)转膜

  • 根据目的蛋白大小,选择合适的转膜条件(见附表)。
4、封闭
  • 转膜完成后,将膜取出,放入合适的抗体孵育槽中,加入Western Blocking Buffer 室温孵育1h,加入TBST Buffer洗涤3次,每次5 min。
5、抗体孵育

根据所使用的一抗种类,选择进行下述其中1项的具体步骤

(1)对于无偶联的一抗

  • a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗体说明书推荐比例进行稀释,室温孵育1.5h或4℃过夜孵育。
  • b. TBST Buffer洗涤4次,每次5 min。
  • c. 按一抗来源选取合适的HRP偶联二抗,按照合适比例进行稀释,室温孵育1h。
  • d. TBST Buffer洗涤4次,每次5 min。
  • e. 继续进行后续曝光操作。

(2)对于偶联有HRP的一抗

  • a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗体说明书推荐比例进行稀释,室温孵育1.5h或4℃过夜孵育。
  • b. 用TBST Buffer洗涤4次,每次5 min。
  • c. 继续进行后续曝光操作。
6、曝光
  • a. 吸取等体积ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ混匀,配制成发光检测工作液。推荐用量为每10cm2的膜使用1-2 mL发光检测工作液即可。
  • b. 用镊子将膜取出,膜的下缘轻轻接触吸水纸,去除膜上多余的液体。用移液枪吸取工作液并均匀覆盖转印膜,室温孵育 1-2 minutes,此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
  • c. 获取WB结果:
    1) 传统压片曝光显影:将膜固定于片夹内。暗室内压片1分钟,立即显影定影,根据结果再调整压片时间获取最佳信噪比图片。或直接分别压片 30 秒、1、3、5分钟,然后一起显影定影观察结果。
    2) 化学发光成像仪获取电子图片:将膜放置到成像仪内,参考仪器说明书设置合适的参数以获取优化图片。同时应根据靶蛋白的生物学性质如丰度等来调节成像参数。

附表1:BSA标准品稀释

1mg/ml BSA(μl) 稀释液(μl) 对应的蛋白含量(mg/ml)
0 20 0
1 19 0.05
2 18 0.1
4 16 0.2
8 12 0.4
12 8 0.6
16 4 0.8
20 0 1

附表2:分离胶浓度的选择

分子量(kDa) 分离胶浓度
X≤10 15%
10<X≤15 13.5%
15<X≤25 12%
25<X≤35 11%
35<X≤40 10%
40<X≤55 9%
55<X≤70 8%
70<X≤100 7%
100<X 6%
备注:X为目的蛋白大小

附表3:分离胶配制

分离胶浓度 6% 7% 8% 9% 10% 11% 12% 13.5% 15%
去离子水(mL) 5.3 4.9 4.6 4.3 4.0 3.65 3.3 2.8 2.3
30%丙烯酰胺 (mL) 2 2.4 2.7 3.0 3.3 3.65 4.0 4.5 5.0
1.5M Tris-HCL(pH8.8) (mL) 2.5
10%SDS(mL) 0.1
10%AP(mL) 0.1
TEMED(mL) 0.01
总体积(mL) 10

附表4:5%浓缩胶配方

5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶
去离子水(mL) 1.1 2.1 2.7 3.4 4.1
30%丙烯酰胺 (mL) 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0
1.0M Tris-HCL(pH6.8) (mL) 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75
10%SDS(mL) 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
10%AP(mL) 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
TEMED(mL) 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006
总体积(mL) 2 3 4 5 6

附表5:转膜条件选择

分子量(kDa) 建议转膜条件(湿转)
X≤10 恒流200mA,30min
10<X≤15 恒流200mA,40min
15<X≤20 恒流200mA,50min
20<X≤50 恒流200mA, 1kDa/min+20min
50<X≤100 恒流200mA, 1kDa/min+30min
100<X≤150 恒流250mA, 1kDa/min+20min
150<X≤180 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在3h内)
180<X 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在4h内)
备注:X为目的蛋白大小以上为建议转膜条件,可根据使用转移设备的转膜效率、目的分子量大小等综合选择合适的转膜条件。针对大分子量或极小分子量蛋白,尤其注意需合理调整转膜液、转膜条件、转膜温度等问题。
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IHC-P

IHC-P免疫组织化学标准操作流程(石蜡切片——非磷酸化项目检测)

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

电磁炉、压力锅、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、光学显微镜、移液器、孵育湿盒、抗原修复盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液:0.01M PBS pH7.2±0.2; 0.01M pH7.2 PBST;
  • (2) 修复液(可选):
    pH6.0 0.01M柠檬酸修复液(1L):C6H8O7•H2O 0.4g;NaC6H5O7•2H2O 3g;pH6.0;
    pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液(1L):C4H11NO3 1.21g;C10H14N2Na2O8•2H2O 0.37g;pH9.0。
  • (3) 3%过氧化氢(需新鲜配制,30% H2O2与dH2O体积比1:9);
  • (4) 抗体稀释液:1X PBS + 5% 正常血清 + 0.3% Triton™ X-100;
  • (5) EnVision Systems检测体系, HRP显色系统: HRP RABBIT/MOUSE及配套DAB显色液;
  • (6) 脱蜡液、无水乙醇(分析纯)、去离子水(dH2O)、苏木素、中性树胶封片剂。

二、实验步骤

1.脱蜡、水化:
  • (1)烤片:将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上,将其放入65℃的恒温箱中烤片30分钟;同时将脱蜡液1缸一起放入65℃的恒温箱中;
  • (2)脱蜡至水:将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温,5分钟后,将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中,并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、95%乙醇、80%乙醇的顺序依次将石蜡切片放入缸中,每缸5分钟;用流水清洗切片5分钟
注意:流水清洗时水流不能直接对着切片;操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
2.内源性过氧化物酶灭活:
  • 将切片完全浸入到3%双氧水溶液中,室温,孵育10分钟;完成后流水清洗5分钟。
注意:内源性酶含量高的组织,可以延长灭活时间至15-20分钟;双氧水需新鲜配制,可提前5-10分钟配制3%的双氧水。
3.抗原修复(可选):
  • (1)方法一,低pH值高压热修复:在高压锅中,加入pH6.0柠檬酸抗原修复液,高火预热;待修复液沸腾后将切片置于其中,并完全浸泡组织,盖好锅盖,扣上压力阀,高火继续加热;待限压阀开始转动喷气后调至中火,同时开始计时3分钟;计时结束后离开热源,自来水冲洗(约15s),安全阀降落后开盖,待修复液温度降至室温后,用缓冲液PBST洗涤3次,每次1min。
  • (2)方法二,高pH值高压热修复:在高压锅中,加入pH9.0 EDTA抗原修复液,高火预热;待修复液沸腾后将切片置于其中,并完全浸泡组织,盖好锅盖,扣上压力阀,高火继续加热;待限压阀开始转动喷气后调至中火,同时开始计时2分钟;计时结束后离开热源,自来水冲洗(约15s),安全阀降落后开盖,待修复液温度降至室温后,用缓冲液PBS洗涤3次,每次1min。
注意:修复液需完全浸没切片上组织;修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序;修复液可根据实验需求自行选用修复液;修复时间可根据组织前处理状态适当调整。
4.染色:
  • (1)擦干组织周围水分,用免疫组化疏水笔在组织周围划圈,PBST洗涤2次,每次1min。
  • (2)一抗孵育:甩干组织周围水分,在组织切片上滴加已稀释的一抗,水平放置于孵育湿盒中,于室温(25℃)孵育1.5小时;
  • (3)洗涤:去除抗体工作液,用缓冲液PBST洗涤3次,每次5分钟;
  • (4)二抗孵育:甩干组织周围水分,在组织切片上滴加二抗工作液,水平放置于孵育湿盒中,于室温(25℃)孵育30分钟;
  • (5)洗涤:去除切片上的二抗工作液,用缓冲液PBST洗涤3次,每次5分钟;
  • (6)显色:显色前5分钟,配置DAB显色工作液,C液:B液体积比1:50,充分混匀;在组织切片上滴加显色工作液,室温(25℃)孵育8分钟;
  • (7)洗涤:将切片浸入大量dH2O中即可终止显色,流水冲洗2分钟;
  • (8)复染:将切片浸入苏木素中浸泡20秒,再用流水清洗2分钟;
  • (9)返蓝:将切片浸入氨水中浸泡2min,返蓝2min,再用流水清洗2分钟。
注意:染色过程中需一直保持切片处于湿润状态;染色过程中所有试剂使用过程中均需保证完全覆盖切片上组织;不同二抗及检测系统敏感性不同,因此对应一抗最佳稀释比可能会有差异;不同厂家苏木素复染程序略有不同。
5.脱水、透明、封片:
  • (1)脱水:将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡2次,每次1分钟;高温(55℃-60℃)下完全干燥;
  • (2)透明:将切片于二甲苯中浸入1次,每次1min;
  • (3)封片:在切片中心滴加适量中性树胶,并加盖盖玻片。
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IF/ICC

免疫荧光实验操作流程(细胞样本)

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

4℃冰箱、恒温恒湿箱、通风橱、移液器、避光孵育湿盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液:0.01M pH7.2±0.2 TBS ;0.01M pH7.2±0.2 TBST
  • (2) 固定液:4%中性甲醛固定液(TBS缓冲液配制)
  • (3) 抗体稀释液:1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
  • (4) 通透剂:0.3% Triton X-100(TBS缓冲液配制)
  • (5) 二抗(可选):
    使用兔源一抗可选二抗:
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074;
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073;
    使用鼠源一抗可选二抗
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077;
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076;
  • (6) 染核试剂:1mg/mL DAPI(用时使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制)
  • (7) 去离子水(dH2O)、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1.样本前处理
  • (1) 弃去培养基,在细胞上缓慢加入常温TBS,清洗2次,每次5秒;
  • (2) 细胞固定:在细胞上覆盖 4%中性甲醛固定液(TBS缓冲液配制),置于4℃,固定15min;固定液需足量;
  • (3) 固定液的清洗:去除固定液,使用4℃预冷的TBS缓冲液,漂洗3次,每次5分钟;
  • (4) 通透:对于细胞骨架,细胞器或细胞核定位蛋白,可增加通透步骤,使用冰甲醇冰上处理5-10min(可选);
注意:需避免实验操作时温差过大或温度骤变;固定液需保证足量,可过量使用;甲醛有毒性,加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作。
2.染色步骤
  • (1)封闭:用5%空白山羊血清将样本完全覆盖,切片需放置于湿盒内,细胞孔板可直接将孔板密封好,置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min;
  • (2)一抗孵育:去除封闭液,直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液,样本需完全覆盖,切片需放置于湿盒内,细胞孔板可直接将孔板密封好,置于4℃孵育过夜;
  • (3)复温:将样本置于常温,复温15min,去除抗体工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (4)二抗孵育:在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液,样本需完全覆盖,避光,37℃,孵育1小时;去除二抗工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (5)染核:在样本上滴加DAPI工作液,使用0.01M pH7.2±0.2 TBS缓冲液配制,DAPI溶液:TBS缓冲液体积比1:1000,避光,室温,孵育30分钟;去除DAPI工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (6)细胞孔板可直接加入抗荧光衰减封片剂后,于荧光显微镜下观察并采集图像;细胞涂片滴加抗荧光衰减封片剂,然后加盖盖玻片封片,再于荧光显微镜下观察并采集图像;细胞爬片可取出,盖在滴加抗荧光衰减封片剂的载玻片上后,于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意:实验中,所有试剂滴加应准确、快速、足量,不能出现干片的情况;染色步骤从二抗孵育开始,后续所有步骤都需注意避光操作;染色完成后需及时观察并采集图像,避免干燥和荧光物质淬灭。

免疫荧光实验操作流程(石蜡切片)

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、移液器、避光孵育湿盒、抗原修复盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液:0.01M pH7.2±0.2 TBS ;0.01M pH7.2±0.2 TBST
  • (2) 修复液(可选):
    pH6.0 0.01M柠檬酸修复液(1L):C6H8O7•H2O 0.4g;NaC6H5O7•2H2O 3g;pH6.0;
    pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液(1L):C4H11NO3 1.21g;C10H14N2Na2O8•2H2O 0.37g;pH9.0。
  • (3) 封闭液:5%空白山羊血清
  • (4) 抗体稀释液:1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
  • (5) 二抗:
    使用兔源一抗可选二抗:
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074;
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073;
    使用鼠源一抗可选二抗:
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077;
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076;
  • (6) 染核试剂:1mg/mL DAPI(用时使用0.01M pH7.2±0.2 TBS配制)
  • (7) 去离子水(dH2O)、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1.水化/脱蜡:
  • (1) 烤片:将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上,将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟;同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中;
  • (2) 脱蜡至水:将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温,5分钟后,将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中,并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、95%乙醇的顺序依次将石蜡切片放入缸中,每缸5分钟;用流水清洗切片5分钟。
注意:流水清洗时水流不能直接对着切片;操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
2.抗原修复:
  • (1)方法一,微波热修复:将切片浸入盛有修复液的修复盒中,将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上;整体放入微波炉中,高火加热3分钟后停火,微波炉内静置5分钟;再高火加热3分钟后停火,微波炉内静置5分钟;随后中低火加热1分钟后停火,微波炉内静置5分钟,然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。
    注意:修复液需完全浸没切片上组织;修复过程中严禁打开微波炉门;修复完成后不可快速冷却;修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
  • (2)方法二,高压热修复:在高压锅中,加入抗原修复液,高火预热;待修复液沸腾后将切片置于其中,并完全浸泡组织,盖好锅盖,扣上压力阀,高火继续加热;待限压阀开始转动喷气后调至中火,同时开始计时3分钟;计时结束后离开热源,自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后,用缓冲液洗涤3次,每次1min。
    注意:修复液需完全浸没切片上组织;修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序;修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
3.染色:
  • (1)封闭:用5%空白山羊血清将样本完全覆盖,切片需放置于湿盒内,置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min;
  • (2)一抗孵育:去除封闭液,直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液,样本需完全覆盖,切片需放置于湿盒内,置于4℃孵育过夜;
  • (3)复温:将样本置于常温,复温15min,去除抗体工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (4)二抗孵育:在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液,样本需完全覆盖,避光,37℃,孵育1小时;去除二抗工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (5)染核:在样本上滴加DAPI工作液,使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制,DAPI溶液:0.01M pH7.2 TBS缓冲液体积比1:1000,避光,室温,孵育30分钟;去除DAPI工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
  • (6)滴加抗荧光衰减封片剂,然后加盖盖玻片封片,再于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意:实验中,所有试剂滴加应准确、快速、足量,不能出现干片的情况;染色步骤从二抗孵育开始,后续所有步骤都需注意避光操作;染色完成后需及时观察并采集图像,避免干燥和荧光物质淬灭。
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IP

IP检测

一、实验试剂

  • (1)Protein A/G Magnetic beads
  • (2)裂解液&洗杂液:Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)(RM00022)
  • (3)蛋白酶抑制剂(RM02916)
  • (4)封闭液:含 3 %BSA 的 1X PBS
  • (5)1×PBS 缓冲液(RM00012)
  • (6)5× SDS sample buffer
  • (7)Control IgG (AC005/ AC011/AC034)

二、实验步骤

1、样本处理

(1)贴壁培养细胞

  • a. 去除贴壁细胞的培养液,用PBS或无血清培养基清洗1次,低速离心,弃上清,留取沉淀。
  • b. 107细胞加入1ml Cell lysis buffer for IP(已加入蛋白酶抑制剂),移液器轻轻吹打,使裂解液和细胞充分接触。2-8℃旋转15min,20转/min。
  • c. 低温下超声1min。
  • d. 12000rpm,4℃离心10min,小心吸取上清。

(2)悬浮培养细胞

  • a. 低速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。
  • b. 107细胞加入1ml Cell lysis buffer for IP(已加入蛋白酶抑制剂),移液器轻轻吹打,使裂解液和细胞充分接触。2-8℃旋转15min,20转/min,充分裂解后应无明显沉淀。
  • c. 低温下超声1min。
  • d. 12000rpm,4℃离心10min,小心吸取上清。

(3)组织样本

  • a. 把组织剪切成细小的碎片。
  • b. 取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织,迅速用液氮研磨,研磨过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解,按照每100-200mg组织加入1ml Cell lysis buffer for IP(已加入蛋白酶抑制剂)。
  • c. 4℃旋转混匀裂解15min。
    (步骤b,c也可采用以下过程:每100-200mg组织加入1ml Cell lysis buffer for IP(已加入蛋白酶抑制剂)。低温下用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆,直至充分裂解,过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。)
  • d. 低温下超声2min。
  • e. 12000rpm,4℃离心10min,小心吸取上清。
2、磁珠预处理
  • (1)将Protein A/G Magnetic beads颠倒或漩涡混匀,翻转瓶身发现底部无黑色沉淀即可。
  • (2)取10-15μl Protein A/G beads至新的EP管中,放在磁力架上,待溶液澄清后,用移液器吸弃保护液。
  • (3)将EP管从磁分离器上取下来,加入1ml Cell lysis buffer for IP混匀,放置在磁力架上收集磁珠,用移液器吸弃洗杂液,重复2次。
  • (4)将EP管从磁分离器上取下来,加入1mL的3% BSA,置于翻转混合仪4℃封闭1h.
  • (5)重复步骤3),备用。
3、磁珠、抗原-抗体复合物结合
  • (1)将含有抗原的样品(300μl,总蛋白量200-1000μg,剩余体积用 Cell lysis buffer for IP(已加入蛋白酶抑制剂)补齐)中加入目标抗体(0.5-5μg),置于翻转混合仪4℃下反应2h或过夜。
  • (2)将上述完成抗体-抗原结合的复合物与备用好的磁珠进行混合,置于4℃下反应2h。
  • (3)将上述磁珠-抗体-抗原复合物放在磁力架上进行分离,收集上清液,以备后续检测。
  • (4)向离心管中加入1mlCell lysis buffer for IP,用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散,然后进行磁力架分离,弃上清液;从磁力架上取下离心管,重复洗涤3次,共洗涤4次。
4、抗原洗脱

(1)变性洗脱

此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。

  • a. 从磁力架上取下离心管,向其中加入35μl 1X SDS sample Buffer混合均匀,室温静置10min,置于磁力架上进行磁性分离,收集上清液。
  • b. 加入10X DTT,95℃加热10min,进行SDS-PAGE检测。

(2)非变性洗脱

  • a. 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入35μl洗脱液,混合均匀,室温孵育10min。
  • b. 置于磁力架上进行磁性分离,收集洗脱液至新的EP管中。
  • c. 加入中和液中和至pH7.0-8.0。用于后期功能分析。
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