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KOValidated重组兔单抗

[KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)

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筛选器：

Western blot analysis of extracts of NIH/3T3 cells, using LC3B antibody (A19665) at 1:1000 dilution.NIH/3T3 cells were treated by Chloroquine (50 μM) at 37℃ for 20 hours.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25ug per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 60s.

Western blot analysis of extracts of various cell lines, using LC3B antibody (A19665) at 1:1000 dilution.293T cells and C6 cells were treated by Chloroquine (50 μM) at 37℃ for 20 hours.Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.Lysates/proteins: 25ug per lane.Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.Detection: ECL Basic Kit (RM00020).Exposure time: 30s.

Immunohistochemistry of paraffin-embedded human brain using [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665) at dilution of 1:100 (40x lens).Perform microwave antigen retrieval with 10 mM PBS buffer pH 7.2 before commencing with IHC staining protocol.

Immunohistochemistry of paraffin-embedded rat brain using [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665) at dilution of 1:100 (40x lens).Perform microwave antigen retrieval with 10 mM PBS buffer pH 7.2 before commencing with IHC staining protocol.

Immunofluorescence analysis of 293T Treated with Chloroquine and 293T cells using [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665) at dilution of 1:100 (40x lens). Blue: DAPI for nuclear staining.

Immunoprecipitation analysis of 300ug extracts of 293T cells using 3ug LC3B antibody (A19665). Western blot was performed from the immunoprecipitate using LC3B antibody (A19665) at a dilition of 1:1000.

All(6)|
货号: A19665
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产品内部验证

反应物种Human, Mouse, Rat
产品应用测试种属及综合评分
WBHuman: Mouse: Rat:
IHCHuman: Mouse: Rat:
IFHuman: Mouse: Rat:
推荐稀释比
  • WB 1:500 - 1:2000
  • IHC 1:50 - 1:200
  • IF 1:50 - 1:200
  • IP 1:50 - 1:200
理论分子量14kDa,16kDa
实际分子量14KDa/16KDa
存储缓冲液Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.
Buffer: PBS with 0.02% sodium azide,0.05% BSA,50% glycerol,pH7.3.
阳性样本293T,C6,NIH/3T3
细胞定位Cytoplasm,Cytoplasmic vesicle,Endomembrane system,Lipid-anchor,autophagosome,autophagosome membrane,cytoskeleton
纯化方式Affinity purification

用户验证的应用

应用及物种

IHC (Mus musculus)

WB (Homo sapiens , Gallus gallus , Rattus norvegicus , Mus musculus)

IF (Gallus gallus , Homo sapiens)

抗原信息

免疫原A synthetic peptide of human LC3B.
序列Email for sequence
进行序列比对

实验步骤

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实验步骤

蛋白质印迹法标准操作流程

一、实验试剂及耗材

1、样品制备试剂
  • a. RIPA 裂解液
  • b. 蛋白酶抑制剂
  • c. BCA工作液
  • d. BSA Standard Solution(5mg/ml)（RM00005）
  • e. 1×PBS缓冲液（RM00012）
  • d. 5×loading buffer（RM00001）
2、制胶试剂
  • a．30% Acr-Bis (29:1)（RM00006）
  • b．1 M Tris-HCl (pH6.8)（RM00003）
  • C．1.5M Tris-HCl (pH8.8)（RM00002）
  • d．10%SDS（RM00004）
  • e．10%Ammonium persulfate (APS)（RM00007）
  • f．TEMED（RM00009）
3、电泳、转膜试剂及耗材
  • a. 1X Tris-Glycine SDS Running Buffer（RM00010）
  • b. 1X Western Transfer Buffer（RM00011）
  • c. Filter Paper (7.5×10cm)（RM00019）
  • d. Nitrocellulose membrane（RM00017/ RM02801/ RM00018）
4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂
  • a. 1XTBST Buffer（RM00013）
  • b. 1X Western Blocking Buffer（RK05742）
  • c. Skimmed milk powder（RM00014）
  • d. Bovine Serum Albumin (BSA)（RM02802）
  • e. Western Antibody Dilution Buffer（RK05743）
  • f. HRP 偶联二抗（AS014/AS003）
  • g. SignalFire™ ECL Reagent（RM00020/RM00021）

二、实验步骤

1、样品制备

（1）细胞收集

  • a. 贴壁培养细胞收集
    去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养基清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
  • b. 悬浮培养细胞收集
    速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。手指轻弹细胞，使其松散。
  • c. 组织样本收集
    把组织剪切成细小的碎片，越小越好。取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。

（2）总蛋白提取

  • a. 细胞/组织裂解
    将装有细胞沉淀或组织碎片的容器完全插入冰中。细胞沉淀按照1mL裂解液/107个细胞(1个T75培养瓶细胞量)的比例加入相应体积的裂解液（细胞量足够时都加入3mL，不足时根据细胞量计算），裂解20min，每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s。组织碎片按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重复5次，使组织尽量碾碎。（裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂）。
  • b. 离心
    把裂解好的样品配平后，置于预冷的高速冷冻离心机中，12000 rpm，15min。
  • c. 蛋白变性
    完成离心后，上清即为蛋白提取液。吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入1/4上清体积的5×Loading Buffer（最终工作液为1X)，待干式恒温器温度升至95℃后，将1.5mL离心管插入加热孔中，95℃加热变性10min，待液体完全冷却后置于-20℃保存。

（3）蛋白浓度测定（BCA法）

  • a. BCA工作液的配置
    根据样品数量，按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B（50:1）配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。
  • b. 标准品测定
    取10μl蛋白标准品（5mg/ml BSA）稀释至50μl，使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1*PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中，加稀释液补足到20μl（见附表）。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，如果样本不足20μl，需加稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
2、凝胶电泳

（1）制胶器安装

  • 根据使用说明书安装。

（2）分离胶制备

  • 根据不同蛋白大小，选择不同浓度的分离胶（见附件表）。将制备好的胶溶液注入预先安装好的制胶器中，加入异丙醇封胶。室温水平放置30min左右。注意防止胶溶液产生气泡并注入制胶器中；注胶前再加入TEMED，防止注胶前凝固；注入异丙醇时需沿玻板一边缓慢拖动加入。

（3）浓缩胶制备

  • 分离胶凝固后，沿玻板一边倒出异丙醇，并用滤纸吸干。再根据需要的体积制备浓缩胶（见附表）。将制备好的胶溶液注入制胶器中，并把准备好的样品梳沿玻板一端缓慢插入胶溶液中，室温水平放置20-30min。注意样品梳与胶溶液之间避免气泡产生。

（4）上样

  • 待浓缩胶凝固好后，双手垂直拔出样品梳，并用Tris-Glycine SDS Running Buffer注入到内外槽中，形成闭合回路。用移液器吸取样品垂直梳孔上样，蛋白含量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm即可。

（5）电泳

  • 上样完以后，连通电泳仪电源，注意正负极需连接正确，设定适宜的电泳参数，浓缩胶电泳参数为恒压80V，待样本进入分离胶时，可将电泳调至120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时，停止电泳，关闭电泳仪电源。
3、转膜

（1）准备工作

  • a. 转膜缓冲液至少提前2h （即开始电泳后）放入-20℃冰箱预冷。
  • b. 根据胶体大小选择,将Filter Paper及Nitrocellulose membrane剪裁至合适尺寸。
  • c. 目的蛋白＞20KD选择0.45μm NC膜；目的蛋白＜20KD选择0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜，选择完毕后将NC膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用，注意如使用的是PVDF膜需先放入甲醇中浸泡5-10min，再放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

（2）转膜

  • 取出玻板中的凝胶，在夹板上依次放一块多孔垫、三张滤纸、凝胶、NC膜、三张滤纸、一块多孔垫（“三明治”结构），将转好的膜放在转膜槽，按一定的条件进行转膜。（见附表）
4、封闭
  • 将膜从“三明治”结构中取出，放入合适的抗体孵育槽中，加入Western Blocking Buffer室温孵育1h，一张6.3×8.3cm大小的膜加入6~7ml即可。
5、一抗孵育
  • a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
  • b. 封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中，室温2h或4℃过夜。
6、洗涤
  • 一抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。
7、二抗孵育
  • a. 一抗洗涤结束前10min，将二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
  • b. 洗涤结束后，将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中，室温1h。
8、洗涤
  • 二抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。
9、曝光
  • a. 根据膜的大小，按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液，按比例吸取等体积的 SolutionⅠ和 SolutionⅡ混匀，配制成发光检测工作液。
  • b. 用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上，使其均有覆盖，室温孵育 1-2min，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
  • c. 压片检测：将膜固定于片夹内。暗室内压片 1 分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30 秒、1、3、 5 分钟，然后一起显影定影观察结果。
  • d. 荧光成像仪检测：将膜放置到荧光成像仪内，参考仪器说明书进行检测。

附表1：BSA标准品稀释

1mg/ml BSA(μl) 稀释液(μl) 对应的蛋白含量（mg/ml）
0 20 0
1 19 0.05
2 18 0.1
4 16 0.2
8 12 0.4
12 8 0.6
16 4 0.8
20 0 1

附表2：分离胶浓度的选择

分子量（kDa) 分离胶浓度
X≤10 15%
10<X≤15 13.5%
15<X≤25 12%
25<X≤35 11%
35<X≤40 10%
40<X≤55 9%
55<X≤70 8%
70<X≤100 7%
100<X 6%
备注：X为目的蛋白大小

附表3：分离胶配制

分离胶浓度 6% 7% 8% 9% 10% 11% 12% 13.5% 15%
去离子水（mL） 5.3 4.9 4.6 4.3 4.0 3.65 3.3 2.8 2.3
30%丙烯酰胺 （mL） 2 2.4 2.7 3.0 3.3 3.65 4.0 4.5 5.0
1.5M Tris-HCL(pH8.8) （mL） 2.5
10%SDS（mL） 0.1
10%AP（mL） 0.1
TEMED（mL） 0.01
总体积（mL） 10

附表4：浓缩胶配制

5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶 5%浓缩胶
去离子水（mL） 1.1 2.1 2.7 3.4 4.1
30%丙烯酰胺 （mL） 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0
1.0M Tris-HCL(pH6.8) （mL） 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75
10%SDS（mL） 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
10%AP（mL） 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
TEMED（mL） 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006
总体积（mL） 2 3 4 5 6

附表5：转膜条件选择

分子量（kDa) 转膜条件
X≤10 恒流200mA,30min
10 < X≤15 恒流200mA,40min
15< X≤20 恒流200mA,50min
20< X≤50 恒流200mA, 1kDa/min+20min
50< X≤100 恒流200mA, 1kDa/min+30min
100< X≤150 恒流250mA, 1kDa/min+20min
150< X≤180 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在3h内)
180< X 恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在4h内)
备注：X为目的蛋白大小

免疫组织化学标准操作流程（石蜡切片——非磷酸化项目检测）

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、光学显微镜、移液器、孵育湿盒、抗原修复盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液：0.01M PBS pH7.2±0.2; 0.01M pH7.2 PBST;
    试剂名称 1*PBS/L 试剂名称 1*PBST/L
    NaH2PO4 0.23g 1*PBS溶液 1L
    Na2HPO4 1.15g Tween 20 溶液 0.001L
    NaCl 8.5g 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
  • (2) 修复液（可选）：
    pH6.0 0.01M柠檬酸修复液（1L）：C6H8O7•H2O 0.4g；NaC6H5O7•2H2O 3g；pH6.0；
    pH7.0 0.01M PBS修复液（1L）：KH2PO4 0.07g；NaCl 7.89g；Na2HPO4 0.45g；KCl 0.10g；pH7.2-7.4；
    pH8.0 0.05M Tris-EDTA修复液（1L）：C4H11NO3 6.05g；C10H14N2Na2O8•2H2O 0.29g；用稀HCl调至pH8.0；
    pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液（1L）：C4H11NO3 1.21g；C10H14N2Na2O8•2H2O 0.37g；pH9.0。
  • (3) 封闭液：5%空白山羊血清;
  • (4) 3%过氧化氢（需新鲜配制，30% H2O2与dH2O体积比1:9）;
  • (5) 抗体稀释液：1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100;
  • (6) EnVision Systems检测体系, HRP显色系统： HRP RABBIT/MOUSE及配套DAB显色液;
  • (7) 脱蜡液、无水乙醇（分析纯）、去离子水（dH2O）、Mayer’s苏木素、中性树胶封片剂。

二、实验步骤

1．水化/脱蜡：
  • （1）烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；
  • （2）脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟。
注意：流水清洗时水流不能直接对着切片；操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
2．内源性过氧化物酶灭活：
  • 将切片完全浸入到3%双氧水溶液中，室温，孵育10分钟；完成后流水清洗5分钟。
注意：内源性酶含量高的组织，可以延长灭活时间至15-20分钟；双氧水需新鲜配制，可提前5-10分钟配制3%的双氧水。
3．抗原修复（可选）：
  • （1）方法一，微波热修复：将切片浸入盛有修复液的修复盒中，将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上；整体放入微波炉中，高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；再高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；随后中低火加热1分钟后停火，微波炉内静置5分钟，然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。待修复液温度降至室温后，用缓冲液PBS洗涤3次，每次1min。
  • （2）方法二，高压热修复：在高压锅中，加入抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时2分钟；计时结束后离开热源，自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后，用缓冲液PBS洗涤3次，每次1min。
注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；修复完成后避免快速冷却；修复液可根据实验需求自行选用修复液。
4．染色：
  • （1）封闭：待修复液温度降至室温后，从修复盒中取出切片；用缓冲液PBS清洗切片2次，每次3分钟；去除切片上的缓冲液；在组织切片上滴加5%空白山羊血清封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于37℃恒温孵育30分钟；
  • （2）一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用缓冲液PBS稀释的一抗，水平放置于孵育湿盒中，于4℃孵育过夜；
  • （3）复温：将孵育湿盒取出室温复温15-30分钟，去除抗体工作液，用缓冲液PBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液PBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （4）二抗孵育：在组织切片上滴加二抗工作液后水平放置于孵育湿盒中，于37℃恒温孵育1h；
  • （5）去除切片上的溶液，用缓冲液PBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液PBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （6）显色：显色前5分钟，配置DAB显色工作液，C液:B液体积比1:100，充分混匀；在组织切片上滴加显色工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，通常10-60秒即可得到合适的染色强度；将切片浸入大量dH2O中即可终止显色；
  • （7）复染、返蓝：将切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片，用流水清洗10分钟。
注意：染色过程中需一直保持切片处于湿润状态；染色过程中所有试剂使用过程中均需保证完全覆盖切片上组织。
5．脱水、封片：
  • （1）脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，10秒；高温（55℃-60℃）下完全干燥；
  • （2）封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片。

免疫荧光实验操作流程（细胞样本）

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

4℃冰箱、恒温恒湿箱、通风橱、移液器、避光孵育湿盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液：0.01M pH7.2±0.2 TBS ；0.01M pH7.2±0.2 TBST
    试剂名称 1*TBS/L 试剂名称 1*TBST/L
    Tris 1.21g 1*TBS 1L
    NaCl 8.8g Tween 20 溶液 0.001L
    用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
  • (2) 固定液：4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制）
  • (3) 抗体稀释液：1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
  • (4) 通透剂：0.3% Triton X-100（TBS缓冲液配制）
  • (5) 二抗（可选）：
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074；
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073；
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077；
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076；
  • (6) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制）
  • (7) 去离子水（dH2O）、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1．样本前处理
  • (1) 弃去培养基，在细胞上缓慢加入常温TBS，清洗2次，每次5秒；
  • (2) 细胞固定：在细胞上覆盖 4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制），置于4℃，固定15min；固定液需足量；
  • (3) 固定液的清洗：去除固定液，使用4℃预冷的TBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟；
注意：需避免实验操作时温差过大或温度骤变；固定液需保证足量，可过量使用；甲醛有毒性，加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作。
2．染色步骤
  • （1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
  • （2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于4℃孵育过夜；
  • （3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2±0.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：TBS缓冲液体积比1:500，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （6）细胞孔板可直接加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞涂片滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞爬片可取出，盖在滴加抗荧光衰减封片剂的载玻片上后，于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意：实验中，所有试剂滴加应准确、快速、足量，不能出现干片的情况；染色步骤从二抗孵育开始，后续所有步骤都需注意避光操作；染色完成后需及时观察并采集图像，避免干燥和荧光物质淬灭。

免疫荧光实验操作流程（石蜡切片）

一、实验仪器及试剂

1、实验器材

微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、移液器、避光孵育湿盒、抗原修复盒。

2、实验试剂
  • (1) 缓冲液：0.01M pH7.2±0.2 TBS ；0.01M pH7.2±0.2 TBST
    试剂名称 1*TBS/L 试剂名称 1*TBST/L
    Tris 1.21g 1*TBS 1L
    NaCl 8.8g Tween 20 溶液 0.001L
    用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值 用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
  • (2) 修复液（可选）：
    pH6.0 0.01M柠檬酸修复液（1L）：C6H8O7•H2O 0.4g；NaC6H5O7•2H2O 3g；pH6.0；
    pH7.0 0.01M PBS修复液（1L）：KH2PO4 0.07g；NaCl 7.89g；Na2HPO4 0.45g；KCl 0.10g；pH7.2-7.4；
    pH8.0 0.05M Tris-EDTA修复液（1L）：C4H11NO3 6.05g；C10H14N2Na2O8•2H2O 0.29g；用稀HCl调至pH8.0；
    pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液（1L）：C4H11NO3 1.21g；C10H14N2Na2O8•2H2O 0.37g；pH9.0。
  • (3) 封闭液：5%空白山羊血清
  • (4) 抗体稀释液：1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
  • (5) 二抗：
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074；
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073；
    Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077；
    Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076；
  • (6) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2±0.2 TBS配制）
  • (7) 去离子水（dH2O）、抗荧光衰减封片剂。

二、实验步骤

1．水化/脱蜡：
  • (1) 烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；
  • (2) 脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟。
注意：流水清洗时水流不能直接对着切片；操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
2．抗原修复：
  • （1）方法一，微波热修复：将切片浸入盛有修复液的修复盒中，将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上；整体放入微波炉中，高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；再高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；随后中低火加热1分钟后停火，微波炉内静置5分钟，然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。
    注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开微波炉门；修复完成后不可快速冷却；修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
  • （2）方法二，高压热修复：在高压锅中，加入抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时2分钟；计时结束后离开热源，自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后，用缓冲液洗涤3次，每次1min。
    注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
3．染色：
  • （1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
  • （2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于4℃孵育过夜；
  • （3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：0.01M pH7.2 TBS缓冲液体积比1:500，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （6）滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意：实验中，所有试剂滴加应准确、快速、足量，不能出现干片的情况；染色步骤从二抗孵育开始，后续所有步骤都需注意避光操作；染色完成后需及时观察并采集图像，避免干燥和荧光物质淬灭。

IP检测

一、实验试剂

  • （1）rProtein A/G Plus MagPoly Beads（RM09008）
  • （2）裂解液&洗杂液：Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)（RM00022）
  • （3）蛋白酶抑制剂
  • （4）封闭液：含 3% BSA 的 1X PBS
  • （5）1×PBS 缓冲液(RM00012)
  • （6）5×loding buffer（RM00001）（使用时用去离子水稀释至工作浓度即可）
  • （7）Control IgG （AC005/ AC011/AC034）

二、实验步骤

1、样本处理

（1）贴壁培养细胞

  • a. 取裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
  • b. 去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养基清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
  • c. 按照6孔板每孔加入100~200μl裂解液的比例，加入裂解液。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液作用于细胞1~5s内，细胞会被裂解。
  • d. 1000~12000g，离心3~5min（如果用冷冻离心机4℃效果更佳），取上清。

（2）悬浮培养细胞

  • a. 取裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
  • b. 速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
  • c. 手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔加入100~200μl裂解液的比例，加入NP-40裂解液。通常6孔板每孔加入100~200μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量150~200μl，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应无明显沉淀。
  • d. 1000~12000g，离心3~5min（如果用冷冻离心机4℃效果更佳），取上清。

（3）组织样本

  • a. 取裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
  • b. 把组织剪切成细小的碎片，越小越好。
  • c. 取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。
  • d. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30-60min。（步骤3、4也可采用以下过程：按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例加入NP-40裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。）
  • e. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例，加入裂解液。
  • f. 1000~12000g，4℃离心10~15min（如无低温离心机，室温下离心也可），取上清。
2、磁珠预处理
  • （1）将rProtein A/G Plus MaqPoly Beads颠倒或漩涡混匀，翻转瓶身发现底部无黑色沉淀即可。
  • （2）取30μl rProtein A/G Plus MaqPoly Beads至新的EP管中，放在磁分离器上，待溶液澄清后，用移液器吸弃保护液。
  • （3）将EP管从磁分离器上取下来，加入1ml Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)，混匀，放置在磁分离器上，收集磁珠，用移液器吸弃洗杂液，重复2次。
  • （4）将EP管从磁分离器上取下来，加入1mL的3% BSA，置于翻转混合仪4℃封闭1h.
  • （5）重复步骤3），备用。
3、磁珠、抗原-抗体复合物结合
  • （1）将含有抗原的样品（通常300μl-1000μl，总蛋白量200μg）中加入目标抗体（通常3μg），置于翻转混合仪4℃下反应2h或过夜。
  • （2）将上述完成抗体-抗原结合的复合物与备用好的磁珠进行混合，置于4℃下反应2h或过夜。
  • （3）将上述磁珠-抗体-抗原复合物放在磁分离器上进行分离，收集上清液，以备后续检测。
  • （4）向离心管中加入1ml洗杂液，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液；从磁分离器上取下离心管，重复洗涤两次。
4、抗原洗脱

（1）变性洗脱(此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。)

  • a. 从磁分离器上取下离心管，向其中加入30μl 2X SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，95℃加热15min。
  • b. 置于磁性分离器上进行磁性分离，收集上清液进行SDS-PAGE检测。

（2）非变性洗脱

  • a. 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入50μl洗脱液，混合均匀，室温孵育5min。
  • b. 置于磁性分离器上进行磁性分离，收集洗脱液至新的EP管中。
  • c. 重复步骤1）和2），收集洗脱液，与2）中洗脱液混合，加入中和液中和至pH7.0-8.0。用于后期功能分析。

靶点背景信息

The product of this gene is a subunit of neuronal microtubule-associated MAP1A and MAP1B proteins, which are involved in microtubule assembly and important for neurogenesis. Studies on the rat homolog implicate a role for this gene in autophagy, a process that involves the bulk degradation of cytoplasmic component.

RRIDAB_2862723
基因ID81631
Swiss ProtQ9GZQ8
别名LC3B;ATG8F;MAP1LC3B-a;MAP1A/1BLC3;MAP1LC3B;LC3A/LC3B
研究领域

文献引用 (12)

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CustomerSep 112019
评分
Experiment Type
WB
Sample
Chicken
Description
Exposure:7s