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[KO Validated] LC3B Rabbit mAb

Datasheet Review (1)
概述
货号: A19665
宿主: Rabbit
同种型: IgG
ABclonal:Western blot - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)
ABclonal:Western blot - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)
ABclonal:Immunohistochemistry - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)
ABclonal:Immunohistochemistry - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)
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ABclonal:Immunofluorescence - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)
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Review
ABclonal: review for [KO Validated] LC3B Rabbit mAb(A19665)

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背景

The product of this gene is a subunit of neuronal microtubule-associated MAP1A and MAP1B proteins, which are involved in microtubule assembly and important for neurogenesis. Studies on the rat homolog implicate a role for this gene in autophagy, a process that involves the bulk degradation of cytoplasmic component.

免疫原信息

免疫原A synthetic peptide of human LC3B.
序列Email for sequence
基因ID81631
Swiss ProtQ9GZQ8
别名LC3B;ATG8F;MAP1LC3B-a;MAP1A/1BLC3;MAP1LC3B;LC3A/LC3B
研究领域

应用

反应物种Human, Mouse, Rat
验证应用WBIHCICCIFIPChIPChIPseqRIPFCELISAMeDIPNucleotide ArrayDB
用户验证的应用
推荐稀释比&实验步骤
  • WB   1:500 - 1:2000  [ 实验步骤 ]

    蛋白质印迹法标准操作流程

    一、实验试剂及耗材

    1、样品制备试剂
    • a. RIPA 裂解液
    • b. 蛋白酶抑制剂
    • c. BCA工作液
    • d. BSA Standard Solution(5mg/ml)（RM00005）
    • e. 1×PBS缓冲液（RM00012）
    • d. 5×loading buffer（RM00001）
    2、制胶试剂
    • a．30% Acr-Bis (29:1)（RM00006）
    • b．1 M Tris-HCl (pH6.8)（RM00003）
    • C．1.5M Tris-HCl (pH8.8)（RM00002）
    • d．10%SDS（RM00004）
    • e．10%Ammonium persulfate (APS)（RM00007）
    • f．TEMED（RM00009）
    3、电泳、转膜试剂及耗材
    • a. 1X Tris-Glycine SDS Running Buffer（RM00010）
    • b. 1X Western Transfer Buffer（RM00011）
    • c. Filter Paper (7.5×10cm)（RM00019）
    • d. Nitrocellulose membrane（RM00017/ RM02801/ RM00018）
    4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂
    • a. 1XTBST Buffer（RM00013）
    • b. 1X Western Blocking Buffer（RK05742）
    • c. Skimmed milk powder（RM00014）
    • d. Bovine Serum Albumin (BSA)（RM02802）
    • e. Western Antibody Dilution Buffer（RK05743）
    • f. HRP 偶联二抗（AS014/AS003）
    • g. SignalFire™ ECL Reagent（RM00020/RM00021）

    二、实验步骤

    1、样品制备

    （1）细胞收集

    • a. 贴壁培养细胞收集
      去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养基清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
    • b. 悬浮培养细胞收集
      速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。手指轻弹细胞，使其松散。
    • c. 组织样本收集
      把组织剪切成细小的碎片，越小越好。取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。

    （2）总蛋白提取

    • a. 细胞/组织裂解
      将装有细胞沉淀或组织碎片的容器完全插入冰中。细胞沉淀按照1mL裂解液/107个细胞(1个T75培养瓶细胞量)的比例加入相应体积的裂解液（细胞量足够时都加入3mL，不足时根据细胞量计算），裂解20min，每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s。组织碎片按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重复5次，使组织尽量碾碎。（裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂）。
    • b. 离心
      把裂解好的样品配平后，置于预冷的高速冷冻离心机中，12000 rpm，15min。
    • c. 蛋白变性
      完成离心后，上清即为蛋白提取液。吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入1/4上清体积的5×Loading Buffer（最终工作液为1X)，待干式恒温器温度升至95℃后，将1.5mL离心管插入加热孔中，95℃加热变性10min，待液体完全冷却后置于-20℃保存。

    （3）蛋白浓度测定（BCA法）

    • a. BCA工作液的配置
      根据样品数量，按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B（50:1）配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。
    • b. 标准品测定
      取10μl蛋白标准品（5mg/ml BSA）稀释至50μl，使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1*PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中，加稀释液补足到20μl（见附表）。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，如果样本不足20μl，需加稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
    2、凝胶电泳

    （1）制胶器安装

    • 根据使用说明书安装。

    （2）分离胶制备

    • 根据不同蛋白大小，选择不同浓度的分离胶（见附件表）。将制备好的胶溶液注入预先安装好的制胶器中，加入异丙醇封胶。室温水平放置30min左右。注意防止胶溶液产生气泡并注入制胶器中；注胶前再加入TEMED，防止注胶前凝固；注入异丙醇时需沿玻板一边缓慢拖动加入。

    （3）浓缩胶制备

    • 分离胶凝固后，沿玻板一边倒出异丙醇，并用滤纸吸干。再根据需要的体积制备浓缩胶（见附表）。将制备好的胶溶液注入制胶器中，并把准备好的样品梳沿玻板一端缓慢插入胶溶液中，室温水平放置20-30min。注意样品梳与胶溶液之间避免气泡产生。

    （4）上样

    • 待浓缩胶凝固好后，双手垂直拔出样品梳，并用Tris-Glycine SDS Running Buffer注入到内外槽中，形成闭合回路。用移液器吸取样品垂直梳孔上样，蛋白含量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm即可。

    （5）电泳

    • 上样完以后，连通电泳仪电源，注意正负极需连接正确，设定适宜的电泳参数，浓缩胶电泳参数为恒压80V，待样本进入分离胶时，可将电泳调至120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时，停止电泳，关闭电泳仪电源。
    3、转膜

    （1）准备工作

    • a. 转膜缓冲液至少提前2h （即开始电泳后）放入-20℃冰箱预冷。
    • b. 根据胶体大小选择,将Filter Paper及Nitrocellulose membrane剪裁至合适尺寸。
    • c. 目的蛋白＞20KD选择0.45μm NC膜；目的蛋白＜20KD选择0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜，选择完毕后将NC膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用，注意如使用的是PVDF膜需先放入甲醇中浸泡5-10min，再放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

    （2）转膜

    • 取出玻板中的凝胶，在夹板上依次放一块多孔垫、三张滤纸、凝胶、NC膜、三张滤纸、一块多孔垫（“三明治”结构），将转好的膜放在转膜槽，按一定的条件进行转膜。（见附表）
    4、封闭
    • 将膜从“三明治”结构中取出，放入合适的抗体孵育槽中，加入Western Blocking Buffer室温孵育1h，一张6.3×8.3cm大小的膜加入6~7ml即可。
    5、一抗孵育
    • a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
    • b. 封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中，室温2h或4℃过夜。
    6、洗涤
    • 一抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。
    7、二抗孵育
    • a. 一抗洗涤结束前10min，将二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
    • b. 洗涤结束后，将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中，室温1h。
    8、洗涤
    • 二抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。
    9、曝光
    • a. 根据膜的大小，按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液，按比例吸取等体积的 SolutionⅠ和 SolutionⅡ混匀，配制成发光检测工作液。
    • b. 用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上，使其均有覆盖，室温孵育 1-2min，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
    • c. 压片检测：将膜固定于片夹内。暗室内压片 1 分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30 秒、1、3、 5 分钟，然后一起显影定影观察结果。
    • d. 荧光成像仪检测：将膜放置到荧光成像仪内，参考仪器说明书进行检测。

    附表1：BSA标准品稀释

    1mg/ml BSA(μl)稀释液(μl)对应的蛋白含量（mg/ml）
    0200
    1190.05
    2180.1
    4160.2
    8120.4
    1280.6
    1640.8
    2001

    附表2：分离胶浓度的选择

    分子量（kDa)分离胶浓度
    X≤1015%
    10<X≤1513.5%
    15<X≤2512%
    25<X≤3511%
    35<X≤4010%
    40<X≤559%
    55<X≤708%
    70<X≤1007%
    100<X6%
    备注：X为目的蛋白大小

    附表3：分离胶配制

    分离胶浓度6%7%8%9%10%11%12%13.5%15%
    去离子水（mL）5.34.94.64.34.03.653.32.82.3
    30%丙烯酰胺 （mL）22.42.73.03.33.654.04.55.0
    1.5M Tris-HCL(pH8.8) （mL）2.5
    10%SDS（mL）0.1
    10%AP（mL）0.1
    TEMED（mL）0.01
    总体积（mL）10

    附表4：浓缩胶配制

    5%浓缩胶5%浓缩胶5%浓缩胶5%浓缩胶5%浓缩胶
    去离子水（mL）1.12.12.73.44.1
    30%丙烯酰胺 （mL）0.330.50.670.831.0
    1.0M Tris-HCL(pH6.8) （mL）0.250.380.50.630.75
    10%SDS（mL）0.020.030.040.050.06
    10%AP（mL）0.020.030.040.050.06
    TEMED（mL）0.0020.0030.0040.0050.006
    总体积（mL）23456

    附表5：转膜条件选择

    分子量（kDa)转膜条件
    X≤10恒流200mA,30min
    10 < X≤15恒流200mA,40min
    15< X≤20恒流200mA,50min
    20< X≤50恒流200mA, 1kDa/min+20min
    50< X≤100恒流200mA, 1kDa/min+30min
    100< X≤150恒流250mA, 1kDa/min+20min
    150< X≤180恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在3h内)
    180< X恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在4h内)
    备注：X为目的蛋白大小
  • IHC   1:50 - 1:200  [ 实验步骤 ]

    免疫组织化学标准操作流程（石蜡切片——非磷酸化项目检测）

    一、实验仪器及试剂

    1、实验器材

    微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、光学显微镜、移液器、孵育湿盒、抗原修复盒。

    2、实验试剂
    • (1) 缓冲液：0.01M pH7.2 PBS ；0.01M pH7.2 PBST;
      试剂名称1*PBS/L试剂名称1*PBST/L
      NaH2PO40.23g1*PBS溶液1L
      Na2HPO41.15gTween 20 溶液0.001L
      NaCl8.5g用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
    • (2) 修复液（可选）：0.01M pH7.2 PBS修复液；0.01M pH9.0 Tris-EDTA修复液；0.01M pH6.0 柠檬酸修复液;
    • (3) 封闭液：5%空白山羊血清;
    • (4) 3%过氧化氢（需新鲜配制，30% H2O2与dH2O体积比1:9）;
    • (5) EnVision Systems检测体系, HRP显色系统： HRP RABBIT/MOUSE及配套DAB显色液;
    • (6) 脱蜡液、无水乙醇（分析纯）、去离子水（dH2O）、Mayer’s苏木素、中性树胶封片剂。

    二、实验步骤

    1．水化/脱蜡：
    • （1）烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；
    • （2）脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟。
    注意：流水清洗时水流不能直接对着切片；操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
    2．灭活：
    • 将切片完全浸入到3%双氧水溶液中，室温，孵育10分钟；完成后流水清洗5分钟。
    注意：内源性酶含量高的组织，可以延长灭活时间至15-20分钟；双氧水需新鲜配制，可提前5-10分钟配制3%的双氧水。
    3．抗原修复：
    • 将切片浸入盛有修复液（一般情况下用0.01M pH7.2 PBS修复液）的修复盒中，将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上；整体放入微波炉中，高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；再高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；随后中低火加热1分钟后停火，微波炉内静置5分钟，然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。
    注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开微波炉门；修复完成后不可快速冷却；修复液可根据实验需求自行换用0.01M pH9.0 Tris-EDTA修复液或0.01M pH6.0 柠檬酸修复液。
    4．染色：
    • （1）封闭：待修复液温度降至室温后，从修复盒中取出切片；用缓冲液PBS清洗切片2次，每次3分钟；去除切片上的缓冲液；在组织切片上滴加5%空白山羊血清封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于37℃恒温孵育30分钟；
    • （2）一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用缓冲液PBS稀释的一抗，水平放置于孵育湿盒中，于4℃孵育过夜；
    • （3）复温：将孵育湿盒取出室温复温15-30分钟，去除抗体工作液，用缓冲液PBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液PBS洗涤3次，每次5分钟；
    • （4）二抗孵育：在组织切片上滴加二抗工作液后水平放置于孵育湿盒中，于37℃恒温孵育1h；
    • （5）去除切片上的溶液，用缓冲液PBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液PBS洗涤3次，每次5分钟；
    • （6）显色：显色前5分钟，配置DAB显色工作液，C液:B液体积比1:100，充分混匀；在组织切片上滴加显色工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，通常10-60秒即可得到合适的染色强度；将切片浸入大量dH2O中即可终止显色；
    • （7）复染、返蓝：将切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片，用流水清洗10分钟。
    注意：染色过程中需一直保持切片处于湿润状态；染色过程中所有试剂使用过程中均需保证完全覆盖切片上组织。
    5．脱水、封片：
    • （1）脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，10秒；高温（55℃-60℃）下完全干燥；
    • （2）封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片。
  • IF   1:50 - 1:200  [ 实验步骤 ]
    • 细胞样本

      免疫荧光实验操作流程（细胞样本）

      一、实验仪器及试剂

      1、实验器材

      4℃冰箱、恒温恒湿箱、通风橱、移液器、避光孵育湿盒。

      2、实验试剂
      • (1) 缓冲液：0.01M pH7.2 TBS ；0.01M pH7.2 TBST
        试剂名称1*TBS/L试剂名称1*TBST/L
        Tris1.21g1*TBS1L
        NaCl8.8gTween 20 溶液0.001L
        用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
      • (2) 固定液：4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制）
      • (3) 封闭液：5%空白山羊血清
      • (4) 通透剂：0.3% Triton X-100（TBS缓冲液配制）
      • (5) 二抗：
        Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074；
        Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073；
        Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077；
        Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076；
      • (6) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制）
      • (7) 去离子水（dH2O）、抗荧光衰减封片剂。

      二、实验步骤

      1．样本前处理
      • (1) 弃去培养基，在细胞上缓慢加入常温TBS，清洗2次，每次5秒；
      • (2) 细胞固定：在细胞上覆盖 4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制），置于4℃，固定15min；固定液需足量；
      • (3) 固定液的清洗：去除固定液，使用4℃预冷的TBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟；
      • (4) 通透（可选）：加入TBS缓冲液配制的0.3% Triton X-100室温孵育10min，TBS漂洗3次，每次5分钟（膜蛋白可省略细胞通透步骤）；
      注意：需避免实验操作时温差过大或温度骤变；固定液需保证足量，可过量使用；甲醛有毒性，加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作。
      2．染色步骤
      • （1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
      • （2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于4℃孵育过夜；
      • （3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
      • （4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
      • （5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：0.01M pH7.2 TBS缓冲液体积比1:500，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
      • （6）细胞孔板可直接加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞涂片滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞爬片可取出，盖在滴加抗荧光衰减封片剂的载玻片上后，于荧光显微镜下观察并采集图像。
      注意：实验中，所有试剂滴加应准确、快速、足量，不能出现干片的情况；染色步骤从二抗孵育开始，后续所有步骤都需注意避光操作；染色完成后需及时观察并采集图像，避免干燥和荧光物质淬灭。
    • 组织样本

      免疫荧光实验操作流程（石蜡切片）

      一、实验仪器及试剂

      1、实验器材

      微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、移液器、避光孵育湿盒、抗原修复盒。

      2、实验试剂
      • (1) 缓冲液：0.01M pH7.2 TBS ；0.01M pH7.2 TBST
        试剂名称1*TBS/L试剂名称1*TBST/L
        Tris1.21g1*TBS1L
        NaCl8.8gTween 20 溶液0.001L
        用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
      • (2) 修复液（可选）：0.01M pH9.0 Tris-EDTA修复液；0.01M pH6.0 柠檬酸修复液
      • (3) 封闭液：5%空白山羊血清
      • (4) 二抗：
        Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074；
        Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073；
        Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077；
        Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076；
      • (5) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制）
      • (6) 去离子水（dH2O）、抗荧光衰减封片剂。

      二、实验步骤

      1．水化/脱蜡：
      • (1) 烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；
      • (2) 脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟。
      注意：流水清洗时水流不能直接对着切片；操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
      2．抗原修复：
      • 将切片浸入盛有修复液（一般情况下用0.01M pH9.0 Tris-EDTA修复液）的修复盒中，将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上；整体放入微波炉中，高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；再高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；随后中低火加热1分钟后停火，微波炉内静置5分钟，然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。
      注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开微波炉门；修复完成后不可快速冷却；修复液可根据实验需求自行换用0.01M pH6.0 柠檬酸修复液。
      3．染色：
      • （1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
      • （2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于4℃孵育过夜；
      • （3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
      • （4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
      • （5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：0.01M pH7.2 TBS缓冲液体积比1:500，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
      • （6）滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像。
      注意：实验中，所有试剂滴加应准确、快速、足量，不能出现干片的情况；染色步骤从二抗孵育开始，后续所有步骤都需注意避光操作；染色完成后需及时观察并采集图像，避免干燥和荧光物质淬灭。
理论分子量14kDa,16kDa
实际分子量14kDa,16kDa
存储缓冲液Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.
Buffer: PBS with 0.02% sodium azide, 50% glycerol, pH7.3.
实验方法Western blotting    
阳性样本HeLa,293T,C6,NIH/3T3
细胞定位Cytoplasm,Cytoplasmic vesicle,Endomembrane system,Lipid-anchor,autophagosome,autophagosome membrane,cytoskeleton
纯化方式Affinity purification

[KO Validated] LC3B Rabbit mAb 检测图片

ABclonal:Western blot - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665) }

Western blot - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)

Western blot analysis of extracts of various cell lines, using LC3B antibody (A19665) at 1:1000 dilution.293T cells, LC3B knockout (KO) 293T cells, C6 cells and NIH/3T3 cells were treated by Chloroquine (50 μM) at 37℃ for 20 hours.
Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.
Lysates/proteins: 25ug per lane.
Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.
Detection: ECL Basic Kit (RM00020).
Exposure time: 5s.
ABclonal:Western blot - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665) }

Western blot - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)

Western blot analysis of extracts of Hela cells, using LC3B pAb (A19665) at 1:1000 dilution.Hela cells were treated by Chloroquine (50 μM) at 37℃ for 20 hours.
Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.
Lysates/proteins: 25ug per lane.
Blocking buffer: 3% BSA.
Detection: ECL Basic Kit (RM00020).
Exposure time: 5s.
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Immunohistochemistry - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)

Immunohistochemistry of paraffin-embedded Rat brain using LC3B antibody (A19665) at dilution of 1:100 (40x lens).
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Immunohistochemistry - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)

Immunohistochemistry of paraffin-embedded Human brain using LC3B antibody (A19665) at dilution of 1:100 (40x lens).
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Immunohistochemistry - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)

Immunohistochemistry of paraffin-embedded Mouse spinal cord using LC3B antibody (A19665) at dilution of 1:100 (40x lens).
ABclonal:Immunofluorescence - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665) }

Immunofluorescence - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)

Immunofluorescence analysis of C6 cells, untreated(right) and Chloroquine treated(50 μM, 37℃ for 20 hours;left) using LC3B antibody (A19665) at dilution of 1:100. Blue: DAPI for nuclear staining.
ABclonal:Immunofluorescence - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665) }

Immunofluorescence - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)

Immunofluorescence analysis of HeLa cells, untreated(right) and Chloroquine treated(50 μM, 37℃ for 20 hours;left) using LC3B antibody (A19665) at dilution of 1:100. Blue: DAPI for nuclear staining.
ABclonal:Immunofluorescence - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665) }

Immunofluorescence - [KO Validated] LC3B Rabbit mAb (A19665)

Immunofluorescence analysis of NIH/3T3 cells, untreated(right) and Chloroquine treated(50 μM, 37℃ for 20 hours;left) using LC3B antibody (A19665) at dilution of 1:100. Blue: DAPI for nuclear staining.

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CustomerSep 112019
Review for [KO Validated] LC3B Rabbit mAb(A19665)5
Cat.No
A19665
Experiment Type
WB
Sample
Chicken
Description
Exposure:7s

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CustomerSep 112019
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Cat.No
A19665
Experiment Type
WB
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Chicken
Description
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