免疫组化操作指南- ABclonal

什么是多重荧光免疫组化？

多重荧光免疫组化（Multiplex Immunohistochemistry, mIHC）是一种基于免疫学原理的高通量空间蛋白质组学技术，通过在单张组织切片中同步检测多个（通常≥3个）抗原靶标，结合高分辨率成像和生物信息学分析，解析复杂组织微环境中细胞表型、功能状态及空间拓扑关系的技术体系。该方法基于酪胺信号放大的多重顺次免疫染色技术，允许同时检测单个细胞或组织样本上的多个目标靶点，全面研究细胞组成、细胞功能和细胞间相互作用。

mIHC与IHC，IF的区别及优势？

mIHC

IHC

检测靶点数

信号特点

抗体种属适配

染色

显色基团

成本及实验便捷性
7-10

分辨率和特异性高；信号稳定持久

无要求

重复抗体孵育+染色+洗脱，即可进行多重染色

荧光素

抗体易适配
1-3

信号强度一般；易淬灭，易受干扰

一抗、二抗需要不同来源进行匹配

针对样本以及靶点特性进行设计

荧光素

不同来源一抗+二抗搭配，≥3重时，抗体搭配困难
1-3

信号强弱定性分析，需要设置对照判断

一抗、二抗需要不同来源进行匹配

多重时需要连续进行切片

DAB或快红等

不同来源一抗+二抗搭配，≥3重时，抗体搭配困难

mIHC研究工具

多重荧光免疫组化（mIHC）TSA试剂盒

类型	产品名称	货号
Plus版TSA试剂盒	TSA Fluorescence Double Staining Plus Kit{多重荧光染色(TSA)试剂盒Plus(双标三色)(兔鼠二抗)}	RK05902P
	TSA Fluorescence Triple Staining Plus Kit{多重荧光染色(TSA)试剂盒Plus(三标四色)(兔鼠二抗)}	RK05903P
	TSA Fluorescence Quadra Staining Plus Kit{多重荧光染色(TSA)试剂盒Plus(四标五色)(兔鼠二抗)}	RK05904P
	TSA Fluorescence Penta Staining Plus Kit {多重荧光染色(TSA)试剂盒Plus(五标六色)(兔鼠二抗)}	RK05905P
	TSA Fluorescence Double Staining Plus Kit{多重荧光染色(TSA)试剂盒Plus(双标三色)(兔二抗)}	RK50025P
	TSA Fluorescence Triple Staining Plus Kit{多重荧光染色(TSA)试剂盒Plus(三标四色)(兔二抗)}	RK50026P
	TSA Fluorescence Quadra Staining Plus Kit {多重荧光染色(TSA)试剂盒Plus(四标五色)(兔二抗)}	RK50027P
	TSA Fluorescence Penta Staining Plus Kit {多重荧光染色(TSA)试剂盒Plus(五标六色)(兔二抗)}	RK50028P

TSA试剂盒配套试剂

产品名称	货号

多重荧光免疫组化展示案例收起

人乳腺癌组织

基于Ki67（增殖活性）、CD3E（T细胞浸润）和CD35（补体调控）的多维空间共定位网络解析，揭示了乳腺癌免疫-补体微环境互作机制，为精准预后分层及靶向免疫-补体调控轴的联合治疗策略提供了关键分子依据。

产品名称	货号	应用	种属

人T细胞淋巴瘤组织

通过多重免疫组化（mIHC）技术,同步检测Ki67、CD3E和CD35的表达，可系统分析T细胞淋巴瘤的增殖活性、肿瘤细胞表型及免疫微环境特征。

产品名称	货号	应用	种属

人乳腺癌（HER2 3+）组织

通过多重免疫组化（mIHC）技术，联合检测Ki67、HER2和AR的表达，可综合分析乳腺癌的增殖活性、分子分型特征及预后相关性。

产品名称	货号	应用	种属

人胰腺组织

利用多重免疫组化（mIHC）技术，同步检测Ki67、CD34和TROP-2的表达，可评估胰腺癌的增殖活性、血管生成特征及TROP-2靶向治疗潜力，为生物学行为分析、预后预测及个体化治疗策略提供依据。

产品名称	货号	应用	种属

多重荧光免疫组化如何工作？

样本准备及抗原修复收起

样本准备

I. 石蜡切片：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-95%乙醇5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min，蒸馏水洗;
II. 冰冻切片：冰冻切片固定10-30min，PBS洗5min，重复3次，滴加0.1-0.5% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重复3次;
III. 细胞爬片或者细胞涂片：细胞样本固定10-30min，PBS洗5min重复3次，滴加0.1-0.5% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重复3次。

抗原修复

I. 组织切片置于盛满 pH 9.0 EDTA 碱性抗原修复液或者 pH 6.0 柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（也可以用高压 1-2 min 100℃水煮 15 min 95℃水浴 20 min 等其他热修复方法）;
II. 中火8 min，停火8 min，转中低火 7 min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片;
III. 自然冷却后将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5 min。
（修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定，细胞样本可省略此步骤。）

阻断内源性过氧化物酶

I. 切片放入 3%过氧化氢溶液，室温避光孵育 15min;
II. 将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5 min。

样本封闭收起

I. 切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用 3% BSA-PBS（或者其他封闭液）均匀覆盖组织，室温封闭 30 min。

抗体孵育收起

I. 一抗孵育：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗 X，切片平放于避光湿盒内4℃孵育过夜或者 37℃ 2 h（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；
II. 二抗孵育：玻片置于 PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5 min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的 HRP 二抗覆盖组织，避光室温孵育 50 min，PBS 洗三次；
III. TSA信号放大：切片滴加荧光反应液均匀覆盖组织室温反应 2-15min，PBS洗三次（预实验可先染3min洗干净荧光染料后显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适继续进行后续抗体染色流程）。

抗体洗脱收起

I. 石蜡切片置于抗原修复液中95℃水浴25-40min（根据不同抗体亲和力灵活调整时间）或者滴加适量 37℃预热至完全溶解的mIHC 专用抗体洗脱液（冰冻切片爬片骨组织建议用，推荐货号RM02984）覆盖样本，37℃放置 5-20min；
II. 弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本 37℃放置 5-20min，弃洗脱液，PBS 洗三次，每次 5min（石蜡切片可用热修复洗脱或者抗体洗脱液洗脱，细胞及冰冻切片需用抗体洗脱液进行洗脱）。
III. 如多重染色，请结合实际需求，重复上述抗体孵育I-III和抗体洗脱I-II步骤。

细胞复染收起

I. 玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

封片和镜检收起

I. 玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
II. 镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

什么是免疫组织化学？

免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）一种利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，来确定组织细胞内的特异性抗原，并对其进行定位、定性以及定量的研究方法；通过IHC技术，可以在病理形态学上对特定靶点蛋白进行分析，是临床病理诊断中重要的检测手段，尤其在疑难疾病的诊断和鉴别应用中，发挥着极其重要的作用，如肿瘤分型、来源鉴别、微小病灶鉴定等。

免疫组织化学如何工作？（以石蜡切片为例，IHC-P）

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IHC研究工具

免疫组化试剂盒

产品名称	货号

免疫组化配套试剂

产品名称	货号

组织固定收起

固定目的

组织中样本固定的目的：进行抗原的固定的同时，维持组织以及组织中细胞、亚细胞结构，需结合抗原蛋白的表位及对应一抗的灵敏度，来进行固定方法的优化。
常见的组织固定液体有交联剂和有机溶剂：

交联剂：如多聚甲醛、福尔马林等，通过与蛋白质、核酸等生物分子形成交联，从而固定细胞和组织的结构，但可能影响抗原性，后续需要进行抗原修复；
有机溶剂：（如甲醇，乙醇，丙酮等），通过脱水和沉淀蛋白质来固定样本，但不推荐用于膜蛋白的检测。

固定步骤

I. 取材：使用无菌技术，从动物或人体中，取得所需的组织样本。对于组织块，厚度要均匀，不宜过大，一般0.2-0.3cm，面积一般为1.0cm×1.0cm×0.2cm，以便于固定液能够充分渗透；
II.初步处理：如果组织样本带有血液或其他体液，应先用生理盐水或PBS进行冲洗，以去除这些可能影响固定效果的物质；
III.固定：将组织样本放入固定液中。常用的固定液有4%中性多聚甲醛溶液，冰冻切片/神经组织可以使用OCT包埋剂。固定液的量通常为组织体积的10-20倍，以确保组织能够充分浸入固定液中。大组织标本应切开固定，以免中间部分自溶解腐败。固定时间根据组织类型和实验要求而定，一般固定时间室温18-24小时；
IV.固定后的处理：固定完成后，将组织从固定液中取出，用流水冲洗数分钟，以去除残留的固定液和可能产生的结晶。

石蜡包埋与切片收起

石蜡包埋

I. 脱水处理：将固定后的组织样本依次浸泡在不同浓度的乙醇溶液中（如70%、80%、90%、100%），每个浓度浸泡时间约为1小时，以去除组织中的水分。最后在100%乙醇中浸泡24小时，以确保完全脱水；
II. 透明化：将脱水后的组织样本浸泡在二甲苯中，通常需要两次，每次约30分钟，以去除乙醇并使组织透明化；
III. 浸蜡：将透明化后的组织放入熔化的石蜡中，通常在60°C下浸泡2-4小时，以确保石蜡充分渗透组织；
IV. 包埋：将浸入石蜡的组织放入包埋模具中，加入更多的熔化石蜡，待其冷却固化。确保组织在模具中位置正确，以便后续切片；

冷却和切片

待石蜡完全冷却后，将包埋好的组织取出，切成所需厚度的切片(通常为3-4微米)，并放置在载玻片上；
II. 切片机设置：将包埋好的石蜡块放入切片机中，调整切片厚度，确保切割平滑；
III. 切片：缓慢移动刀片，切割出均匀的切片，注意避免产生气泡和撕裂；
IV. 贴片：将切片转移到预先加热的载玻片上，使用温水浴帮助切片平展；
V. 干燥：将贴好的切片放置在烘箱中，通常在60°C下烘干1小时，以去除多余的水分。

切片脱蜡与水化收起

I. 烤片：将组织切片放置于60°C的烘箱中加热30至60分钟。此过程加速了脱蜡速率，提高了后续实验操作的效果；
II. 脱蜡：将切片依次浸入二甲苯溶液（Ⅰ）中浸泡10分钟，随后转移至二甲苯溶液（Ⅱ）中继续浸泡10分钟，以完成脱蜡处理。此双重脱蜡步骤有效确保了切片上石蜡的彻底清除；
III. 水化：水化是脱蜡之后的关键步骤，用于清除残留的脱蜡溶剂及二甲苯，并引导细胞切片逐步适应水性介质。首先将切片浸泡在无水乙醇（Ⅰ）中静置10分钟，随后更换为无水乙醇（Ⅱ）中继续浸泡10分钟。然后，切片需按浓度梯度依次浸泡在95%乙醇、70%乙醇及50%乙醇溶液，各停留5分钟；
IV. 最后，在蒸馏水中浸泡5分钟。

抗原修复收起

I. 选择修复方法：根据抗原的性质和实验需求，选择合适的抗原修复方法，如微波热修复法、高压修复法、酶消化法等；
II. 微波热修复法：将切片置于柠檬酸钠修复液中，放入微波炉中高火处理，间隔加热与冷却多次，以暴露抗原位点；
III. 高压修复法：将切片放入抗原修复液中，置于高压锅中加热至沸腾，盖上压力阀至喷汽后持续1-4分钟；
IV. 酶消化法：对于某些细胞内抗原和细胞间质抗原，使用蛋白酶进行消化处理，具体酶的种类、浓度、pH值、消化时间和温度需根据实验需求进行调整；
V. 冷却和洗涤：修复完成后，将切片置于凉水中冷却至室温，然后用PBS洗涤3次，每次5分钟。

H_₂O_₂处理收起

I. 阻断内源性过氧化物酶：在切片上滴加3% H_₂O_₂溶液，室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性；
II. 洗涤：用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，以去除残留的H_₂O_₂。

封闭收起

封闭液的选择：根据实验需求选择合适的封闭液，如5% BSA（牛血清白蛋白）或5%正常山羊血清等。
封闭液的准备：将封闭液现配现用，确保其新鲜度和有效性。

I. 封闭：将封闭液均匀滴加到组织切片上，确保封闭液完全覆盖整个组织区域；
II. 孵育：将切片放入湿盒中，在室温或37°C下孵育30分钟，让封闭液与组织切片充分作用；
III. 洗涤：封闭结束后，用PBS或TBS等缓冲液洗涤切片，以去除未结合的封闭液和可能存在的杂质。

抗体孵育收起

一抗孵育

I. 选择一抗：根据实验目的选择特异性高、亲和力强的一抗。一抗应该与目标抗原的种属来源、类型等相匹配；
II. 稀释一抗：根据一抗的效价和实验要求，用适当的稀释液（如PBS、TBS等）稀释一抗；
III. 孵育：将稀释好的一抗均匀滴加在已封闭的组织切片上，放入湿盒中，室温（或37°C）孵育1小时，使一抗与抗原充分结合；
IV. 洗涤：孵育完成后，使用洗涤液（如PBST或TBST）在摇床上缓慢摇动洗涤切片，以去除未结合的一抗和其他杂质。洗涤三次，每次5分钟；

二抗孵育

I. 稀释二抗：参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液或其他适当的溶液稀释二抗（如为即用型二抗，则不可稀释直接使用）；
II. 孵育二抗：将稀释好的二抗滴加在已经过一抗孵育并洗涤的组织切片上，室温孵育20-30分钟；
III. 洗涤：孵育完成后，使用洗涤液（如PBST或TBST）在摇床上缓慢摇动洗涤切片，以去除未结合的二抗和其他杂质。洗涤三次，每次5分钟。

显色和复染收起

I. 显色剂准备：根据所使用的酶标记抗体（如辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP）选择合适的底物。例如，HRP常用的底物为3,3'-二氨基联苯胺（DAB），AP的底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/氯化硝基四氮唑蓝（BCIP/NBT）。按照试剂说明书配制显色剂工作液；
II. 显色：将配制好的显色剂工作液滴加到组织切片上，确保完全覆盖。对于HRP-DAB系统，通常在室温下显色3-10分钟；对于AP-BCIP/NBT系统，显色时间可能稍长，需根据实际情况调整。显色过程中可在显微镜下观察，待阳性信号充分显色而背景较浅时终止反应；
III. 显色终止：用蒸馏水或去离子水轻轻冲洗切片，以终止显色反应。避免用力过猛导致切片脱落；
IV. 复染：为了更好地观察细胞结构，可用苏木素进行复染，使细胞核呈现蓝色。通常室温下孵育2-10分钟，然后用自来水冲洗返蓝；

封片和观察收起

封片

I. 脱水：完成染色后，将组织切片依次置于70%、85%、95%乙醇中脱水，每次1分钟，随后用无水乙醇I和无水乙醇II各浸泡1分钟；
II. 透明：将切片置于二甲苯中透明，每次1分钟，共两次；
III. 封片：在切片上滴加一滴封片剂（如中性树胶或甘油明胶），轻轻覆盖盖玻片，避免产生气泡，并确保盖玻片与切片紧密贴合；
IV. 干燥：让封片剂自然干燥，或在温箱中加速干燥过程。

镜检

I. 显微镜观察：使用光学显微镜或荧光显微镜观察切片，根据实验需求选择合适的观察方法；
II. 图像采集：通过显微镜的摄像头或手机拍照功能采集图像，确保图像清晰且具有代表性；
III. 数据分析：对采集到的图像进行分析，如阳性细胞计数、染色强度评估等。