ApaLI (RK21170)

载体质粒DNA线性化，用于无缝克隆；产生粘性末端，用于传统分子克隆；质粒DNA模板线性化后，再用于ddPCR扩增；用于DNA基因组物理图谱的组建；基因的定位和基因分离；DNA分子碱基序列分析；比较相关的DNA分子和遗传工程。

星号活性(star activity)：也称星活性，在非理想的条件下，切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。这种"星号"活性可能是内切酶的一种普遍特性，如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。

降低星号活性方法：控制甘油浓度(<5% v/v)；控制酶与底物DNA比例 (不同的酶情况不同，防止酶量过大)；低盐浓度(<25 mM)；保持合适的pH值；去除有机溶剂(如DMSO、乙醇等)；防止其他二价离子替代镁离子(如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等)。以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些。

高甘油浓度(≶5% v/v)：酶储存液含50%甘油因此两量不超过反应体积的10%。选择50 μL的标准反应体系，以减少反应过程中水的蒸发而提高甘油浓度。

使用非限制性内切酶最合适反应缓冲液：尽可能使用推荐缓冲液，离子浓度和pH的改变会引起星号活性。

存在有机溶剂(如DMSO、乙醉、DMF等)：确保样品在制备过程中不含任何有机物，如DNA制备过程中可能混入的乙醇。

混有其它二价离子(如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+)：去除样品中二价离子。

大多数限制酶对DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶切的影响有3种可能，即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化DNA的切割能力是限制酶内在和不可预测的特性，因此，为有效的切割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。另外，大部分商业限制酶可用于切割甲基化DNA。

A1：限制性内切酶活性下降：用已知含目的酶切位点的对照DNA测试该酶活性；酶贮存于20°C，-70°C时会冻结避免反复冻融降低酶活；可根据实验要求适当加大酶。

A2：限制性内切酶稀释不正确：用酶存储液或反应缓冲液稀释酶。

A3：DNA不纯，反应条件不佳：纯化DNA；按比例使用新鲜缓冲液重复实验；按照推荐方案进行双酶切或分步酶切等调整到最佳反应条件。

A4：限制性内切酶识别的DNA位点上碱基被甲基化或存在其它修饰：换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶，重新将质粒DNA转化至dcm-、dam-基因型的菌株；将该DNA底物与λDNA混匀进行酶切验证。

A5：部分反应溶液粘在管壁上：全部酶切组分加入完成后，进行混匀并短暂离心。

A6：限制性内切酶含有甘油，粘度大导致取样不准：将酶稀释，增大取样体积。

A7：DNA底物酶切产生的粘性末端退火：电泳前将样品置于65℃孵育5-10 min，然后迅速冰浴。

A8：反应溶液、温度或强烈振荡致使酶变性失活：使用推荐的反应缓冲液及温度，避免强烈振荡。

A9：过度稀释使酶活性降低：适当稀释酶液，反应液稀释的酶液不能长期保存。

A10：反应条件不合适：使用推荐反应体系。

A11：识别位点两侧含有影响酶切效率的序列：增加5-10倍的酶量。

A12：DNA浓度不合适：推荐50 μL反应体系酶切1-2 μg DNA；DNA过量时可适当增加酶量。

A13：DNA被抑制剂污染：与对照DNA样品一起酶切，验证其是否被抑制:重新纯化DNA样品。

A14：DNA可能形成超螺旋：不同酶对超螺旋结构DNA消化效率不一样，可适当加大酶量。

A15：识别位点过于接近DNA末端：一般在识别位点两端各加3个保护碱基可确保酶切效率。

A16：识别位点不存在：验证DNA序列。

A1：酶失活：使用经过验证的酶切底物检测酶的活性。

A2：DNA底物中含SDS、酚、EDTA等抑制物：纯化DNA。

A3：反应条件不合适：检查反应Buffer与反应温度是否是最佳的。

A4：DNA酶切位点被甲基化：换用对该位点甲基化不敏感的同裂酶，或者将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的感受态细胞，重新提取质粒DNA。

A5：DNA位点上存在其它修饰：将DNA底物与λDNA混匀后进行切割验证。

A6：DNA底物不存在该酶的识别位点：换用其它酶切割DNA或过量酶消化进行验证。

A1：内切酶星状活性：检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶/DNA比值过大均可导致星状活性，降低酶的使用量。

A2：其它内切酶污染：用λDNA作底物检查酶切结果。

A3：底物中含其它DNA杂质：电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段。

A1：DNA定量错误（如RNA含量较高）：用无DNase的RNase A消化DNA样品，纯化后再定量。

A2：在酶切反应液中形成非特异性的沉淀：在反应前纯化DNA样品。

A1：保存温度不合适：内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存。

A2：以稀释形式保存：稀释酶液不宜长期存放，应一次使用。

A3：贮藏缓冲液不适当：使用厂家推荐的贮藏缓冲液。

A4：低蛋白浓度：内切酶与500 μg/mL的BSA一起保存。

A1：含磷酸盐的浓度高：纯化DNA样本去除磷酸盐。

A2：酶失活不全或含有ATP酶：延长灭活时间或纯化DNA。

A3：平末端连接：增加T4 DNA连接酶的用量。

A4：外切酶污染：减少酶用量，缩短反应时间，纯化回收DNA。

A5：连接缓冲液中ATP降解：重新配制连接缓冲液，或向连接反应Buffer中补加ATP。

A1：DNA结合有蛋白质：电泳前将酶切产物在65℃处理5 min，并加入0.1%的SDS，然后纯化。

A2：酶中含有DNA外切酶：减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶。

A3：核酸酶污染：制备新的底物样品；使用新的缓冲液和水。

A4：电泳条件不合适：使用新鲜的电泳缓中液和凝胶；合适的电流电压避免过热。