骨细胞培养概述

骨骼系统作为支持和保护身体内部器官的结构框架，主要由软骨和骨骼组成。骨骼生长和发育的过程中涉及到许多细胞类型，包括来源于骨髓间充质干细胞的成骨细胞和软骨细胞，以及来源于造血干细胞的破骨细胞，这些过程都离不开各类细胞因子的参与。

骨细胞培养专用细胞因子

破骨细胞培养常用细胞因子收起
蛋白名称物种Gene ID标签表达系统货号
Recombinant Mouse TNFSF11/RANKL/CD254 ProteinMouse21943N-His＆N-hFCHEK293 cellsRP02134
Recombinant Mouse TNFSF11/RANKL/CD254 Protein (With Carrier)Mouse21943N-His＆N-hFCHEK293 CellsRP02134C
Recombinant Human TNFSF11/RANKL/CD254 ProteinHuman8600N-HiS-hFCHEK293 CellsRP00183S
Recombinant Mouse CSF-1/M-CSF ProteinMouse12977No-TagHEK293 cellsRP01216S
Recombinant Mouse CSF-1/M-CSF Protein (With Carrier)Mouse12977NO-tagHEK293 cellsRP01216SC
Recombinant Human CSF-1/M-CSF ProteinHuman1435C-HisHEK293 cellsRP01221
Recombinant Rat CSF-1/M-CSF ProteinRat78965C-HisHEK293 cellsRP01847
TRAP 染色试剂盒//本产品仅用于科研。破骨细胞显示RPM0052K

破骨细胞培养验证数据展示

部分竞品对比数据展示

RP01216S/RP01216

Mouse M-CSF Protein

Recombinant Mouse CSF-1/M-CSF stimulates cell proliferation of the M-NFS-60 cells.

RP01216S/RP02134

Mouse M-CSF Protein, Mouse TNFSF11/RANKL/CD254 Protein

M-CSF (50 ng/mL) and RANKL (100 ng/mL) induced differentiation of osteoclasts from primary mouse bone marrow cells for 3 days(top);RANKL (100 ng/mL) induced differentiation of osteoclasts from RAW264.7 cells for 5 days (below).
客户培养数据展示
中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
Experiment Type
Cell-based assay
Sample
Mouse bone marrow cells
Product
Recombinant Mouse CSF-1/M-CSF Protein (RP01216S)
Recombinant Mouse TNFSF11/RANKL/CD254 Protein (RP02134)
Description
Osteoclast induced from primary mouse bone marrow cells

操作步骤

细胞因子复溶及保存收起
  • 1. 未添加载体蛋白的产品，如RP01216S及RP02134货号，操作如下：
    使用含0.1% BSA或者10% FBS的无菌PBS将重组M-CSF和RANKL细胞因子复溶至100 μg/mL（10 μg因子加100 μL 含载体蛋白的PBS，100 μg因子加1 mL 含载体蛋白的PBS，以此类推），将复溶后的母液按每次的用量如10 μL/管进行分装，冻存在-20℃以下，随取随用，避免反复冻融。
  • 2. 本身已添加了载体蛋白的产品，如RP01216SC以及RP02134C货号，操作如下：
    使用无菌PBS将重组M-CSF和RANKL细胞因子复溶至100 μg/mL，无需额外添加保护剂（10 μg因子加100 μL PBS，100 μg因子加1 mL PBS，以此类推），将复溶后的母液按每次的用量如10 μL/管进行分装，冻存在-20℃以下，随取随用，避免反复冻融。
  • 3. 含0.1%BSA的PBS配制方法如下：称取10 mg BSA溶解在无菌PBS中，定容至10 mL，用0.22 μm的滤膜过滤除菌后使用。
小鼠骨髓细胞的获得收起
  • 1. 取C57BL/6J雄性小鼠（6-8周龄）颈椎脱臼法处死，手术取出所有股骨和胫骨，并用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净，不要损伤到骨;
  • 2. 将骨移至超净台内，并用盛有70%酒精的无菌培养皿浸泡2-5 min，以消毒灭菌，然后用无菌PBS（含1% P/S）洗2次；
  • 3. 将骨移入另一个盛有PBS（含1% P/S）或RPMI 1640（含1% P/S）的新培养皿中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽取PBS（含1%P/S）或RPMI 1640（含1% P/S），针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至骨完全变白；
  • 4. 收集骨髓悬液，用40 μm细胞筛滤去小碎片和肌肉组织；
  • 5. 滤过液400 g离心5 min，弃上清；
  • 6. 加入5 mL 红细胞裂解液吹打混匀，室温裂解5 min后，400 g离心5 min（如果细胞沉淀仍有较多红细胞，可重复裂解一次）；
  • 7. 使用完全培养基(α-MEM+10%FBS(热灭活)+1% P/S)重悬细胞，即获得小鼠骨髓细胞，一般一只小鼠大约可获得2×107-4×107个骨髓细胞；
  • 注：血清热灭活处理方法，56℃处理30 min。
单核巨噬细胞诱导收起
  • 1. 将获得的小鼠骨髓细胞使用完全培养基(α-MEM+10%FBS(热灭活)+1% P/S)调整密度至2×106-3×106/mL，转移到T25/75瓶或者细胞培养皿，放置CO2培养箱中培养过夜，以去除贴壁较快的其他杂细胞如纤维细胞等；
  • 2. 次日，收集未贴壁细胞，使用完全培养基(α-MEM+10%FBS(热灭活)+1% P/S + 50 ng/mL Mouse M-CSF)调整细胞浓度为2×106-3×106/mL，铺入未TC处理培养板或培养皿中，每隔一天更换完全培养基；
  • 3. 在M-CSF刺激3-5天（72 h-120 h）后即可获得大量单核巨噬细胞。
  • 注：（1）使用未TC处理的培养皿/培养板进行培养，目的是便于将贴壁细胞吹洗下来，避免用胰酶消化影响细胞活率；
    （2）使用完全培养基稀释的M-CSF及RANKL溶液，可以在4℃放置2-3天，用于隔天换液。
成熟的破骨细胞诱导收起
  • 1. 在M-CSF刺激3-5天（72 h-120 h）后即可获得大量巨噬细胞。实验时弃去培养基，使用PBS洗涤一次，加入PBS静置5-10 min后，即可将巨噬细胞吹打下来，离心收集后使用完全培养基(α-MEM+10%FBS(热灭活)+1% P/S+50 ng/mL Mouse M-CSF)重悬计数铺板。
  • 2. 取出一管分装的RANKL母液，使用完全培养基α-MEM+10%FBS(热灭活)+1% P/S+50 ng/mL Mouse M-CSF稀释到终浓度为100-200 ng/mL，用48孔细胞培养板（底面积约1 cm2），细胞数量0.75×104-2×104/100μL/孔，再加入100 μL RANKL蛋白溶液（诱导终浓度50-100 ng/mL）。其他类型细胞培养板，可根据底面积进行等比例换算，密度大约为0.75×104-2×104活细胞/cm2；
  • 3. 隔天换液（48 h换液一次），每天进行镜下观察，一般在RANKL刺激72-96 h后即可观察到较多融合细胞，可以进行TRAP染色；破骨细胞在成熟之后的24 h之内死亡，诱导之后需每天观察分化情况，避免因错过细胞最佳状态而导致实验失败。
  • 注：在诱导成熟的破骨细胞过程中，除了RANKL之外，需要保持添加M-CSF。
破骨细胞TRAP染色鉴定收起
1. 配制TRAP工作液（ABclonal RPM0052K，注意避光操作，现配现用）
  • （1）取50 μL副品红溶液与50 μL亚硝酸钠溶液在洁净离心管中混匀，得到六偶氮副品红溶液；
  • （2）向第（1）步的100 μL六偶氮副品红溶液中加入100 μL AS-BI磷酸盐底物溶液，充分吹吸数次；
  • （3）吸取1.8 mL反应缓冲液加入到第（2）步的混合液中充分混匀；
  • （4）第（3）步的混合液经针式滤器过滤（0.45 μm水系滤膜）即得到TRAP工作液。
  • 注：务必按照所属顺序配制工作液，根据使用量配制，现配现用，避免浪费。
2. 破骨细胞染色
  • （1）细胞固定：吸除细胞培养液，加入4%多聚甲醛（自备），固定15-30 min，蒸馏水洗3次；
  • （2）细胞破膜：以0.2% Triton X-100溶液（自备）覆盖细胞进行破膜处理20-30 min，蒸馏水轻洗3次；
  • （3）孵育染色：将TRAP工作液加到细胞孔板内覆盖细胞，37℃避光孵育15-20 min，蒸馏水洗3次；
  • （4）（可选，自备相关试剂）细胞核复染：吸除孵育液并水洗，以苏木素染液进行染核；
  • （5）镜下观察拍照记录数据（在孔内加入蒸馏水，使液面与孔边缘水平，拍照效果更好）。
注意事项收起
1. 血清质量及灭活处理
  • 血清对于小鼠骨髓细胞诱导分化为破骨细胞影响较大，建议尽量使用高品质血清，并进行灭活处理；
  • 以下是不同血清品牌及处理方法，使用48孔板（底面积约1 cm2），不同RANKL浓度及细胞密度条件下，诱导72 h，10倍镜观察的结果。
2. 细胞密度
  • 细胞不同铺板密度对于小鼠破骨细胞分化有较大的影响，推荐设置不同的密度梯度进行预实验，可以以0.75×104-2×104个活细胞/cm2（底面积）左右进行梯度设置。根据内部检测结果，48孔板（底面积约为1 cm2），使用50 ng/mL RANKL进行刺激，细胞数在1.5-2.5万时，诱导72-84 h形成成熟的破骨细胞效果最佳（左），细胞数在0.5-1万时，诱导84-96 h效果最佳（右）。（仅作为参考，不同试剂和操作，诱导效果可能有差异）
细胞因子复溶及保存收起
  • 1. 未添加载体蛋白的产品，如RP02134，操作如下：
    使用含0.1% BSA或者10% FBS的无菌PBS将重组RANKL细胞因子复溶至100 μg/mL（10 μg因子加100 μL 含载体蛋白的PBS，100 μg因子加1 mL 含载体蛋白的PBS，以此类推），将复溶后的RANKL母液按每次的用量如10 μL/管进行分装，冻存在-20℃以下，随取随用，避免反复冻融。
  • 2. 本身已添加了载体蛋白的产品，如RP02134C，操作如下：
    使用无菌PBS将重组RANKL细胞因子复溶至100 μg/mL，无需额外添加保护剂（10 μg因子加100 μL PBS，100 μg因子加1 mL PBS，以此类推），将复溶后的RANKL母液按每次的用量如10 μL/管进行分装，冻存在-20℃以下，随取随用，避免反复冻融。
  • 3. 含0.1%BSA的PBS配制方法如下：称取10 mg BSA溶解在无菌PBS中，定容至10 mL，用0.22 μm的滤膜过滤除菌后使用。
RAW264.7细胞复苏、传代与冻存收起
复苏
  • 1. 取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴锅中不断摇晃解冻，直至冻存管中无冰晶，此过程尽量在2 min内完成；
  • 2. 准备15 mL离心管，加入2-6 mL完全培养基（DMEM+10% FBS），将冻存管中的细胞悬液移至离心管中，1000 rpm离心3-5 min；
  • 3. 吸弃上清，用10 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，接种至T25瓶中，轻轻摇晃均匀后，放入37℃，5%CO₂细胞培养箱中竖瓶悬浮培养；
  • 注：RAW264.7细胞为半贴壁半悬浮生长，胰酶会刺激细胞分化，不建议使用胰酶消化，因此在诱导破骨细胞实验中，建议使用悬浮培养操作。
传代
  • 1. 细胞计数：将T25瓶中的细胞轻轻吹打均匀，进行计数，当细胞密度达到5×105-1×106个/mL时可传代培养；
  • 2. 接种：准备好新的T25培养瓶加入适量的完全培养基（最终培养体积为10 mL），吸取第（1）步中的细胞接种于新的培养瓶中，接种密度为10-20万/mL（该接种密度下，约3-5天传一代），放入37℃，5% CO₂细胞培养箱中竖瓶悬浮培养；
  • 3. 细胞传代过程中，定期镜检、拍照、记录细胞状态；细胞传3-4代左右，细胞状态良好，可进行破骨细胞诱导分化实验操作；
冻存
  • 1. 建议在3代左右时冻存一批细胞种子以备后续使用；
  • 2. 轻轻将细胞吹打均匀，转移至离心管中并计数，根据计数的密度决定细胞冻存数量，一般推荐的冻存密度为1×106-2×106个活细胞/管，然后1000 rpm离心3-5 min，去除上清液；
  • 3. 将细胞清洗2次（使用4.5 mL PBS溶液+ 0.5 mL 完全培养基重悬并轻轻吹打几次），1000 rpm离心3-5 min，去除上清液；
  • 4. 加入配制好的冻存液（90%完全培养基+10% DMSO）重悬细胞，分装到冻存管中，每管1 mL；
  • 5. 将冻存管放入程序降温盒中进行梯度降温，然后放入-80℃冰箱降温，24 h之后将冻存管转入液氮罐中长期保存。
成熟破骨细胞诱导收起
  • 1. 取出一管分装的RANKL母液，使用完全培养基（α-MEM+10%FBS）稀释到终浓度为100-200 ng/mL（诱导终浓度为50-100 ng/mL）；
  • 2. 收集10代以内，状态良好的RAW264.7细胞，离心后用α-MEM+10% FBS重悬细胞，进行计数铺板，细胞铺板密度一般推荐为0.75-1.5万/cm2，初次实验可设置细胞密度梯度摸索最佳实验条件；
  • 3. 以48孔板（底面积约1 cm2）为例，每孔加入100 μL稀释之后的RANKL蛋白溶液，再加入100 μL含细胞数量为0.75-1.5万的培养基，沿着侧壁快速打入，确保细胞均匀；隔天换液，诱导72-96 h后，可形成成熟的破骨细胞。破骨细胞在成熟之后的24 h之内死亡，诱导之后需每天观察分化情况，避免因错过细胞最佳状态而导致实验失败。
  • 注：使用完全培养基稀释到100-200 ng/mL的RANKL溶液，可以在4℃放置2-3天，用于隔天换液。
破骨细胞TRAP染色鉴定收起
1. 配制TRAP工作液（ABclonal RPM0052K，注意避光操作，现配现用）
  • （1）取50 μL副品红溶液与50 μL亚硝酸钠溶液在洁净离心管中混匀，得到六偶氮副品红溶液；
  • （2）向第（1）步的100 μL六偶氮副品红溶液中加入100 μL AS-BI磷酸盐底物溶液，充分吹吸数次；
  • （3）吸取1.8 mL反应缓冲液加入到第（2）步的混合液中充分混匀；
  • （4）第（3）步的混合液经针式滤器过滤（0.45 μm水系滤膜）即得到TRAP工作液。
  • 注：务必按照所属顺序配制工作液，根据使用量配制，现配现用，避免浪费。
2. 破骨细胞染色
  • （1）细胞固定：吸除细胞培养液，加入4%多聚甲醛（自备），固定15-30 min，蒸馏水洗3次；
  • （2）细胞破膜：以0.2% Triton X-100溶液（自备）覆盖细胞进行破膜处理20-30 min，蒸馏水轻洗3次；
  • （3）孵育染色：将TRAP工作液加到细胞孔板内覆盖细胞，37℃避光孵育15-20 min，蒸馏水洗3次；
  • （4）（可选，自备相关试剂）细胞核复染：吸除孵育液并水洗，以苏木素染液进行染核；
  • （5）镜下观察拍照记录数据（在孔内加入蒸馏水，使液面与孔边缘水平，拍照效果更好）。
注意事项收起
1. RAW264.7细胞来源
  • RAW264.7细胞来源影响破骨细胞的形成，不同来源或不同实验室保存的RAW264.7细胞系，可能由于遗传漂移等原因，导致无法分化为成熟的破骨细胞。（左图为内部检测不同来源RAW264.7细胞诱导效果，48孔板，0.75W/孔，刺激90 h；右图为文献支持，DOI: 10.1111/jcmm.16390）
2. RAW264.7细胞代次及细胞状态
  • RAW264.7细胞培养代数建议在8代以内，保持细胞状态良好，传代次数越多，状态越差，诱导分化越困难；
3. 细胞密度
  • 细胞密度影响破骨细胞的形成，推荐设置不同的密度梯度进行预实验，可以0.75×104-1.5×104个活细胞/cm2（底面积）左右进行梯度设置。以下为不同培养板推荐的细胞密度，因为使用试剂、细胞状态、操作等因素都会影响破骨细胞的形成，以下内容仅作为参考。
细胞孔板孔面积(cm2)推荐测试细胞数范围
细胞96孔板0.330.2-1 W
细胞48孔板0.840.5-2.5 W
细胞24孔板1.931-6 W
细胞12孔板3.851.5-9 W
细胞6孔板9.65-20 W
10 cm2细胞培养皿60.830-250 W
成骨细胞培养常用细胞因子收起

成骨细胞培养验证数据展示

部分竞品对比数据展示

RP02510S

Human/Mouse/Rat BMP-2 Protein

Recombinant Human/Mouse/Rat mature BMP-2 Protein induce alkaline phosphatase production by ATDC5 mouse chondrogenic cells

RP02512S1

Human/Mouse/Rat BMP-4 Protein

Recombinant Human/Mouse/Rat mature BMP-4 Protein induce alkaline phosphatase production by ATDC5 mouse chondrogenic cells

RP01458

Human Mature TGF-beta 1 Protein

Recombinant Human Mature TGF-beta 1 inhibit proliferation of HT‑2 mouse T cells
客户培养数据展示
华中科技大学同济医学院附属协和医院
Experiment Type
Cell-based assay
Sample
MC3T3
Product
Recombinant Human/Mouse/Rat mature BMP-2 Protein (RP02510S)
Description
Hydrogel-loaded BMP-2 (Cat.RP02510S) promoted the osteogenic differentiation of mouse embryonic osteoblastic precursor cell line MC3T3. After 7 days, ALP staining was used to observe the cell differentiation, and the effect was significant.
软骨细胞培养常用细胞因子收起

软骨细胞培养验证数据展示

部分竞品对比数据展示
客户培养数据展示
武汉大学口腔医院
Experiment Type
Cell-based assay
Sample
ESC-H9
Product
Recombinant Human/Mouse/Rat mature TGF-beta 3 Protein (RP00645)
Description
After mesenchymal differentiation of ESC-H9 cells was induced, a special medium containing 20ng/ml TGF-β3 was added to induce their differentiation into chondrocytes for 14 days. Microscopic observation revealed that the differentiation rate of chondrocytes was verified to reach about 80%, and the cytokine effect was excellent.
南京鼓楼医院
Experiment Type
Cell-based assay
Sample
Chondrocytes
Product
Recombinant Human IL-1 beta Protein (RP00002)
Description
Human chondrocytes treated with 25 ng/mL IL-1β for 24 h showed increased expressions of type I collagen (COL I) and type X collagen (COL X), and decreased expressions of type II collagen (COL II) and glycosaminoglycan (ACAN), as expected.